紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上栽培面积最大的豆科牧草，再生能力强，抗逆性好，生长速度快，营养丰富，有“饲草之王”的美称^[1]。当前我国苜蓿产品主要以调制青干草为主，但调制干草的过程中因雨淋、落叶等因素使营养成分损失较大^[2-3]。青贮是保存青饲料营养物质的有效方法。该方法是一个复杂的微生物区系变化过程，涉及到乳酸菌、腐败菌、酵母菌、霉菌、芽胞杆菌等多种微生物^[4]，这些微生物存在于青贮原料、青贮发酵过程中和发酵完成后等所有时期，并与青贮原料种类和青贮时期有很大关系^[5-6]。其中乳酸菌是青贮发酵成功的关键微生物^[7]。

微生物青贮添加剂可有效缩短青贮饲料制作时间，提升青贮饲料制作的成功率，提高青贮饲料品质。目前主要使用的微生物菌种有乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)及部分芽孢杆菌属(Bacillus)等。研究发现，利用枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和植物乳杆菌(L. plantarum)组合对玉米(Zea mays)进行青贮，制作的青贮饲料品质优良^[8]。添加凝结芽孢杆菌(B. coagulans)、植物乳杆菌、粪链球菌(Streptococcus faecalis)和乳酸片球菌(P. acidilactici)的全株玉米青贮在感官评价上均优于未添加微生物的自然发酵组^[9]。

苜蓿青贮的制作要通过晾晒使水分降至65%左右制成半干青贮或者依靠青贮添加剂^[10-13]。苜蓿青贮常用的微生物添加剂为乳酸菌，乳酸菌能够利用发酵糖分产生乳酸，快速降低其pH，有效抑制霉菌等有害微生物的活动，从而降低青贮饲料养分损失提高青贮饲料发酵品质^{[2, 14]}。王丽学等^[15]利用5种乳酸菌对紫花苜蓿进行青贮发现，植物乳杆菌和乳酸片球菌能够显著提高青贮品质。然而，有研究表明仅添加乳酸菌，能够降低有氧稳定性^[16]，通过添加乳杆菌、地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)及不可培养酸杆菌对苜蓿进行裹包青贮，发现3种菌剂能够显著提高苜蓿青贮品质和有氧稳定性^[17]。由于青贮原料的差异，导致苜蓿青贮过程微生物种群变化情况存在很多未知。

随着研究的深入，很多报道从基因水平研究青贮饲料微生物种群组成。徐振上^[18]使用16S rDNA宏基因组技术对玉米青贮过程中细菌群落变化进行分析，结果显示厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteriodetes)三者占据了菌群的95%以上。本研究旨在通过分子生物学技术对苜蓿青贮的微生物菌群进行分析，筛选适合苜蓿青贮的微生物菌种，并对其进行鉴定，开发苜蓿青贮微生物添加剂，改善苜蓿青贮的品质。

1.   材料与方法

1.1   材料

苜蓿品种为阿尔冈金(Algonquin)，河南科技大学实验牧场种植第3年，春季第1茬，初花期刈割后在试验田晾晒24 h，用于苜蓿青贮制作。

培养基^[19]有：MRS培养基[葡萄糖4 g，胰蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，牛肉膏2 g，MnSO₄·4H₂O 0.007 6 g，MgSO₄·7H₂O 0.04 g，Tween-80 0.2 mL，K₂HPO₄ 0.4 g，柠檬酸胺0.4 g (固体培养基加琼脂粉3.2 g)，无菌水200 mL，pH 6.2～6.4]；LB培养基[胰蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，氯化钠2 g (固体培养基加琼脂粉3.2 g)，无菌水200 mL，pH 7.0～7.2]；NA培养基[牛肉膏0.6 g，蛋白胨2 g，氯化钠1 g，无菌水200 mL (固体培养基加琼脂粉3.2 g)，pH 7.2]；PDA培养基[去皮马铃薯40 g，加入200 mL无菌水煮沸20 min，双层纱布过滤后补充水至200 mL，加入葡萄糖4 g (固体培养基加琼脂粉3.2 g)，121 ℃高压灭菌20 min，用乙醇溶解0.02 g氯霉素，加入培养基中]；麦氏培养基[葡萄糖0.2 g，氯化钾0.36 g，酵母粉0.5 g，乙酸钠1.64 g (固体培养基加琼脂粉3.2 g)，蒸馏水200 mL]。

主要试剂：细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，生化试剂购自TAKARA生物公司，其他化学试剂均为分析纯，购自洛阳博冠商贸有限公司。

采用通用引物^[20]，上游：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3′，下游：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2   方法

1.2.1   苜蓿青贮的制作

将刈割的紫花苜蓿晾晒至水分含量为65%左右时，用剪刀剪成1 cm长的小段，装入500 mL广口瓶中，压实密封，厌氧发酵，制作3瓶，每瓶为1个重复。

1.2.2   苜蓿青贮品质评定^[21]

青贮第60天取样，3个重复取样后混合均匀，由具有青贮饲料质量评估经验的3人做现场感官评分，评定标准参考《德国DLG青贮饲料感观评分标准》^[22]分为优(20～16分)、良(15～10分)、中(9～5分)和下(4～0分) 4个等级。评分内容为嗅觉、结构和色泽：嗅觉分5个等级(0～14分)；结构分4个等级(0～4分)；色泽分3个等级(0～2分)。

1.2.3   苜蓿青贮样品宏基因组测序分析

由美因健康科技(北京)有限公司协助完成。

细菌基因组DNA的提取与质量检测：将苜蓿青贮3个重复各取3 g样品混合均匀，按照细菌基因组提取试剂盒说明进行苜蓿青贮中细菌全基因组DNA的提取，利用Nanodrop检测DNA的纯度和浓度，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，然后利用Qubit3.0对DNA浓度进行精确定量。

宏基因组文库的构建及质量检测：使用Covaris超声波破碎仪进行随机打断，选取合适长度的片段，经过末端修复、3′端加A、加接头、纯化、扩增等完成宏基因组文库制备，文库的质量检测为：用Qubit3.0对文库初步定量并稀释至1 ng·μL^–1→Qsep100对文库的Insert Size检测→利用Q-PCR对文库有效浓度进行准确定量。宏基因组文库质检合格后按照有效浓度和目标下机数据量进行上机测序，测序策略为Illumina Hiseq，PE150。

测序完成后，对原始下机数据进行质量控制(Raw Data)、拼接组装、基因预测并构建非冗余基因集(gene catalogue)，然后对得到的基因进行物种和功能上的注释、分类以及丰度统计，在上述分析的基础之上，对样品或样品组间进行相似聚类，分组排序，差异比较等多方向的统计分析，并对结果进行可视化展示。

1.2.4   微生物菌种的筛选

微生物的筛选方法参考文献[7]的操作方法作进一步优化调整。在超净台中将10 g青贮样品剪碎后放入90 mL无菌水混合于150 mL三角瓶中，封口膜封口，置于摇床上震荡30 min，配置1 × 10^–2、1 × 10^–3、1 × 10^–4共3种稀释梯度，取50 μL稀释液滴在MRS、NA、LB、PDA以及麦氏培养基上，用涂布棒将菌液在培养基上涂抹均匀，然后将培养基倒转静置20～30 min，将MRS和麦氏培养基在37 ℃厌氧、NA、LB、PDA在37 ℃有氧条件下培养24～48 h，分离微生物。

1.2.5   微生物菌株的鉴定

形态学鉴定：对所筛菌种进行纯培养，分别在不同的固体培养基上，观察菌落的形态、颜色、大小、光泽等菌落特征，用接种环分别挑取单菌落，进行革兰氏染色^[23]，显微镜下观察菌体颜色、大小、形状、是否有芽孢等菌体特征。

分子生物学鉴定：参照细菌基因组提取试剂盒说明书，提取所筛菌种基因组DNA，扩增菌种的16S rDNA保守序列。对扩增产物进行测序，并通过NCBI Blast N进行保守序列的分析比对。PCR扩增体系为25 uL体系，包括：① 10 × Ex Taq buffer：2.5 μL，② dNTP：2 μL，③ 上游引物：1 μL，④ 下游引物：1 μL，⑤ Ex Taq酶：0.5 μL，⑥ 模板(基因组DNA)：1 μL，⑦ ddH₂O：17 μL。PCR反应条件及程序为：预变性94 ℃ 2 min→35个循环(变性94 ℃ 30 s→复性57 ℃ 30 s→延伸72 ℃ 1 min30 s)→终延伸72 ℃ 10 min→4 ℃保存。

2.   结果与分析

2.1   苜蓿青贮质量评定

对所制作的苜蓿青贮样品进行品质评定，气味评分10.78，结构评分3.22，色泽评分1.56，综合评分15.56，结果显示，青贮品质评定等级为良好。

2.2   苜蓿青贮中微生物种群分析

2.2.1   宏基因组文库基因信息分析

通过构建宏基因组文库，从苜蓿青贮样品中筛选和组装了60 710个基因样品，通过测序得知这些基因总长度为39 948 615 bp，平均长度为720.04 bp，对其进行了编号并计算了基因丰度信息。将这些基因在Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)数据库与Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy)数据库中进行BLAST(balst p)比对分析和功能注释；经过分析苜蓿青贮宏基因组中的基因主要涵盖6大功能类：糖苷水解酶(glycoside hydrolases，GHs)、糖基转移酶(glycosyl transferases，GTs)、多糖裂合酶(polysaccharide lyases，PLs)、碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases，CEs)、辅助氧化还原酶(auxiliary activities，AAs)和碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding modules，CBMs)。

2.2.2   宏基因组文库物种信息分析

利用宏基因组测序技术扩增苜蓿青贮中微生物保守序列，并对基因丰度在0.1%以上的基因序列进行相似性分析和比对(图1)。可以看出，相似性大于95%水平上的微生物物种共有53 587个，分属18个门，28个纲，59个目，87个科，207个属，672个微生物物种。厚壁菌门物种基因丰度可达99.4%，为主要优势微生物群落。序列测定基于目水平的分析，微生物群落数为51 822个，主要以芽孢杆菌目(Bacillales)和乳酸菌目(Lactobacillales)为主，分别占到目水平微生物群落总数的64.5%和18.9%。基于属的水平可分析，微生物群落总数为43 502个，其主要微生物群落为海洋杆菌属(oceanobacillus)、乳杆菌属(Lactobacilli)、芽孢杆菌属(Bacilli)、枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)、乳酸球菌属(Lactococcus)以及部分梭菌属(clostridium)等。其所占比例分别达到了24.9%、14.3%、13.9%、13.2%、5.8%、4.1%。

图  1  苜蓿青贮中微生物菌种群落分析

图中百分数表示在门、纲、目、科、属和种分类水平上基因丰度 > 0.1%的物种比例。

Figure  1.  Analysis of microbial communities in alfalfa silage

The percentages means the proportion of species with gene abundance > 0.1% at the level of phylum, class, order, family, genus and species classification.

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在种的水平对苜蓿青贮微生物菌种分析，结果显示芽孢杆菌菌种所占的比例较大，主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)，短小芽孢杆菌(B. pumilus)以及尚未鉴定到种的部分芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)。海洋杆菌属的微生物菌种主要为O. damuensis及未鉴定到种的部分Oceanobacillus sp.菌株。乳杆菌属微生物菌种主要有植物乳杆菌及短乳杆菌(L. brevis)等。乳酸球菌属的微生物菌种主要为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和乳酸片球菌。肠球菌属的菌株主要是粪肠球菌(E. faecalis)和屎肠球菌(E. faecium)。枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)的菌种主要为V. pantothenticus、V. halodenitrificans以及V. alimentarius等。

2.3   苜蓿青贮主要微生物菌种的筛选

利用MRS培养基厌氧培养的方式从苜蓿青贮中共筛选出13株菌株，暂命名为MRS1、MRS2、MRS3、MRS4、MRS5、MRS6、MRS7、MRS8、MRS9、MRS10、MRS11、MRS12、MRS13；利用麦氏培养基厌氧培养方式筛选出3株菌株，暂命名为MC1、MC2、MC3；PDA培养基好氧培养筛选出8株菌株，暂命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8；利用NA培养基和LB培养基好氧培养分别从苜蓿青贮中筛选出2株和4株菌株，暂命名为NA1、NA3和LB2、LB5、LB6、LB7。

2.4   菌株的形态学鉴定

2.4.1   菌株的菌落特征鉴定结果

从苜蓿青贮中分离出的菌株MRS1～13、MC1～3及NA1的菌落特征为圆形、边缘整齐、表面光滑、中央凸起的乳白色单菌落(图2A)。菌株P5、P8、LB2、LB5、LB6菌落表面不光滑，边缘不整齐，中部有突起的皱褶(图2B)。菌株P1～P4、P6、P7、LB7和NA3的菌落呈白色，边缘不整齐，表面不光滑，有突起的皱褶(图2C)。

图  2  苜蓿青贮中的部分菌株菌落特征

A、B、C分别表示菌株MRS1、LB2、PDA1的菌落特征。

Figure  2.  Bacterial colonies in alfalfa silage

A, B, and C are the colony characteristic of strain MRS1, LB2, and PDA1, respectively.

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2.4.2   菌株的菌体特征鉴定结果

从苜蓿青贮中分离出的菌株MRS1～9、MRS11、MRS12、MRS13、以及MC1、MC2、MC3革兰氏染色结果为革兰氏阳性，短杆状，单个或呈链状排列(图3A)。MRS10和NA1革兰氏染色呈球形，单个或链状排列的革兰氏阳性菌(图3B)。菌株PDA1～8、LB7和NA3革兰氏染色结果为革兰氏阳性、杆状、单个或短链状排列，芽孢中生或端生(图3C)。

图  3  苜蓿青贮中筛选出的部分菌株菌体

A为菌株MRS1革兰氏染色，B为菌株NA1的革兰氏染色，C为菌株PDA1的革兰氏染色。

Figure  3.  Strains isolated from alfalfa silage

A is the gram stain of MRS1, B is the gram stain of NA1, C is the gram stain of PDA1.

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2.5   分子生物学鉴定

提取筛选到的微生物的基因组DNA，以每个菌种基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA序列通用引物对其保守序列进行扩增(图4)。可以看出，所筛菌种均成功扩增出大小约1 500 bp左右的DNA片段。对扩增片段进行序列测定，将序列测定结果经NCBI Blast N进行序列比对发现菌株MRS1～MRS9和MRS11～MRS13以及MC1～MC3与植物乳杆菌(MG551233.1)的相似度达到了99.8%；菌株MRS10与乳酸片球菌菌株(KY550661.1)的相似度达到98.42%；菌株NA1与粪肠球菌(CP028727.1)的相似度达到了98.80%；菌株LB6与阿氏芽孢杆菌(KU052707.1)的相似度达到了99.44%；菌株P1～P4、P6、P7、LB7、NA3与枯草芽孢杆菌菌株(KC422328.1)相似度达到99.58%；菌株LB5、P5与地衣芽孢杆菌菌株(CP035404.1)的相似度达到了99.92%；菌株P8与短小芽孢杆菌菌株(KC692158.1)的相似度达到了99.55%。菌株LB2与解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)菌株(CP029071.1)的相似度达到了99.63%。结合形态学鉴定，初步确定从苜蓿青贮样品中筛选到植物乳杆菌15株，乳酸片球菌和粪肠球菌各1株，各种芽孢杆菌12株。说明苜蓿青贮样品中的微生物菌种以乳酸菌和芽孢杆菌为主。

图  4  试验所筛30株菌株的16S rRNA gene电泳图

M, DL2000; 1– 3：MC1, MC2, MC3; 4 – 12：MRS1, MRS2, MRS3, MRS4, MRS5, MRS6, MRS7, MRS8, MRS9; 13 – 16：MRS10，MRS11, MRS12,MRS13; 17 – 19：NA1，NA3，LB2; 20 – 22：LB5, LB6, LB7; 23 – 30：P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8.

Figure  4.  16S rRNA gene amplification products of the 30 strains screened in this experiment

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3.   讨论与结论

本研究采用宏基因组测序技术对苜蓿青贮中微生物菌落进行分析，结果显示，厚壁菌门微生物的基因丰度高达99.4%，其中海洋杆菌属、乳酸杆菌属以及芽孢杆菌属等基因丰度较大，与徐振上^[18]在青贮玉米中微生物菌群分布的研究结果相似。但本研究在属的水平分析的微生物物种与已有报道差异较大，可能的原因是青贮原料差别所引起，也可能与样品开封后在氧气中暴露的程度有关^{[6, 24]}。

在青贮饲料菌种筛选上，有报道从青贮玉米及苜蓿青贮中筛选出不同的微生物菌种。李旭娇和玉柱^[25]利用传统微生物培养方法从苜蓿青贮饲料中筛选到4株植物乳杆菌。韩吉雨^[26]通过对青贮发酵体系中乳酸菌多样性的研究发现，玉米青贮饲料在发酵第60天时筛选出的微生物有植物乳杆菌。张慧杰等^[27]从阿尔冈金和敖汉两个品种的紫花苜蓿青贮饲料中筛选到了乳酸片球菌。韩吉雨^[26]筛选出的与乳酸片球菌特征一致的菌种，说明乳酸片球菌是苜蓿青贮的另一个主要菌种。除了乳酸菌之外，张涛^[28]、席琳乔等^[29]分别在苜蓿青贮和青贮玉米中筛选到地衣芽孢杆菌的近缘菌种。芽孢杆菌能够产生具有抑制酵母和霉菌的细菌素，能够显著提高青贮饲料的有氧稳定性^[30]，并参与青贮饲料的整个发酵过程。

本研究筛选到植物乳杆菌15株，乳酸片球菌和粪肠球菌各1株，各种芽孢杆菌12株。与已有报道结果基本一致，说明乳酸菌和芽孢杆菌是青贮饲料的主要微生物菌种^{[25, 28]}。传统微生物筛选方法不能完全获得青贮饲料微生物种群的信息。本研究通过宏基因组测序分析了苜蓿青贮中的主要微生物类群，并通过配制相应的培养基筛选到主要的微生物菌种，对微生物种属的鉴定结果与宏基因组测序分析结果相一致。说明宏基因组测序技术能够有效分析苜蓿青贮样品中的微生物组成和种群信息，为筛选和使用苜蓿青贮中的微生物提供很大帮助。