种草基质对木里矿区植被恢复效果的影响
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新疆位于全球酿酒葡萄(Vitis vinifera)黄金种植带上，作为我国主要的优质酿酒葡萄主产区，其种植面积居全国第二，约2.34万hm2，产量居全国第一，约22.18万t，种植面积与产量均占全国总量的25%左右[1]。葡萄渣是葡萄酒酿造生产过程中的副产品，主要由葡萄皮、葡萄籽和葡萄果梗3部分构成，其产出占葡萄加工量的20%～30% [2]。当前，仅有少量的葡萄渣被回收用以花青素提取等精深加工利用，而绝大多数的葡萄渣都被用作肥料或垃圾随意堆弃。解决葡萄渣资源的循环利用，是实现葡萄酒产业可持续发展的重要现实问题。葡萄渣中有着丰富的多糖、多酚、蛋白质、油脂及矿物质等功能成分[3]，将其作为反刍动物的日粮来加以利用，是提高葡萄渣利用率的重要途径。
多年生豆科牧草紫花苜蓿(Medicago sativa)是一种营养丰富、产草量高、家畜喜食的优质蛋白质饲草。新疆北疆大部分地区，在当年刈割最后一茬苜蓿时，由于气温下降等不利因素的影响，调制的苜蓿干草品质较差，将苜蓿制作成青贮饲料是解决此问题的方法之一。苜蓿青贮饲料不但营养价值高，而且可以长期保存，但苜蓿含糖量低，缓冲能高，常规青贮不易成功，且青贮过程中蛋白损失严重[4]。葡萄渣含有的缩合单宁有着多种生物活性[5-6]。单宁可以与蛋白质结合，形成单宁蛋白质复合物对蛋白质起到一定的保护作用[7]；单宁还具有一定的抑菌性，在青贮饲料中添加单宁可以抑制饲料有害微生物的活性，并减少乳酸向乙酸和丁酸的转换[8]。此外，缩合单宁对反刍动物瘤胃氮代谢、微生物调控以及对反刍动物的健康和生产都有着一定的积极作用[9-11]。董文成等[12]研究发现，将葡萄渣按一定比例与苜蓿进行混合青贮，可以降低苜蓿青贮pH，改善青贮发酵品质，提高青贮有氧稳定性。也有研究报道青贮中添加葡萄渣，可快速降低青贮pH，提高青贮发酵品质和不饱和脂肪酸含量[13]。以上研究表明将葡萄渣与苜蓿进行混合青贮，即可合理的利用酿酒副产品葡萄渣，也可弥补苜蓿青贮发酵过程中的不足，但目前关于添加葡萄渣对苜蓿青贮体外消化特征的研究报道还较少。
基于此，针对苜蓿单独青贮营养损失严重，质量较差等问题，本试验以葡萄渣3种不同添加比例与苜蓿进行混合青贮，探讨葡萄渣不同添加量对苜蓿青贮营养发酵品质的影响，并利用瘤胃体外产气法结合产气动力学模型，研究葡萄渣添加对苜蓿青贮瘤胃降解利用的影响，为葡萄渣的饲料化利用提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 原料与添加剂
葡萄渣原料采自新疆中信国安葡萄酒业有限公司玛纳斯县分公司，品种为‘赤霞珠’，原料取回前已风干；苜蓿采自新疆农业大学三坪农场，为当年第3茬收获的新鲜紫花苜蓿(‘新牧4号’)，切碎后待用。青贮所用的添加剂为乳酸菌、纤维分解菌等构成的复合微生物菌剂，由新疆农业科学院提供，活菌数 > 1 × 108 cfu·g−1，按青贮复合菌剂使用方法配置，装入100 mL喷壶中均匀喷洒至物料中。
1.2 青贮试验设计
本试验采用单因素完全随机设计，对照组为紫花苜蓿单独青贮；处理1组(C1)为添加100 g·kg−1 的葡萄渣；处理2组(C2)为添加150 g·kg−1 的葡萄渣；处理3组(C3)为添加200 g·kg−1 的葡萄渣。试验共计4个处理，每个处理重复3次。将处理好的苜蓿与葡萄渣按制作比例混合均匀，按(1 000 ± 100) g·L−1的密度装填入1 L的塑料广口瓶中压实并密封，放置在避光室温处发酵60 d，取样进行相关指标的测定与分析。
1.3 测定项目及方法
1.3.1 青贮饲料营养品质的测定分析
将原料和青贮样在65 ℃烘箱中干燥48 h至恒重，粉碎过筛(0.425 mm)待用。处理好的原料和青贮样品参考Zhang和Zhao [14]描述的方法进行以下指标的测定：干物质(dry matter，DM) (烘干法)，粗脂肪(ether extract，EE) 采用索氏抽提法，粗蛋白质(crude protein，CP)采用凯氏定氮法，中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)采用Van Soest洗涤纤维素分析法[15]，粗灰分(crude ash，CA)采用灰化法。利用分光光度法测定可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrates，WSC)含量，并利用公式计算非纤维性碳水化合物(non-fiber carbohydrates，NFC)含量，NFC = 100 − CP − EE − NDF − Ash。参考蒋慧[16]的方法测定青贮原料乳酸菌、酵母菌和霉菌的数量。利用盐酸－正丁醇法测定葡萄渣单宁含量[17]。
1.3.2 青贮饲料发酵品质的测定分析
取50 g青贮原料，加150 mL蒸馏水，用榨汁机粉碎1 min，汁液经4层纱布过滤后用于后续指标测定。发酵品质中的pH利用酸度计进行测定；采用高效液相色谱法[18]测定乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)和丁酸(butyric acids，BA)；采用苯酚－次氯酸比色法[19]测定氨态氮(ammonia nitrogen，NH3-N)；青贮发酵品质评价采用V-Score评分方法参考日本粗饲料评定手册[20]，具体评分标准如表1所列。
表 1 V-Score评分标准Table 1. Calculation of the V-Score氨态氮
Ammonia nitrogen/%乙酸 + 丙酸
Acetic acid + propionic acid/%丁酸及以上挥发性脂肪酸
Butyric acid and above volatile fatty acid/%V-Score XN 计算式
Formula (YN)XA 计算式
Formula (YA)XB 计算式
Formula (YB)≤ 5 YN = 50 ≤ 0.2 YA = 10 0～0.5 YB = 40 − 80XB Y = YN + YA + YB 5～10 YN = 60 − 2XN 0.2～1.5 YA = (150 − 100XA)/13 > 0.5 0 10～20 YN = 80 − 4XN 1.5 < YA = 0 > 20 YN = 0 XN、 XA、 XB分别为氨态氮、乙酸 + 丙酸和丁酸及以上挥发性脂肪酸的含量； YN、 YA、 YB分别为氨态氮、乙酸 + 丙酸和丁酸及以上挥发性脂肪酸的得分； Y为总得分。
XN, XA, and XB are the content of ammonia nitrogen, acetate acid + propionate acid and butyric acid and above volatile fatty acid, respectively; YN, YA, and YB are the scores of ammonia nitrogen, acetate acid + propionate acid, and butyric acid and above volatile fatty acid, respectively; Y is the total score.1.3.3 青贮饲料体外产气特征相关指标的测定分析
瘤胃液取自3头装有瘤胃瘘管、体重年龄相似、第2胎次的泌乳初期荷斯坦母牛，将瘤胃液与人工瘤胃缓冲液按1 ꞉ 2比例混合均匀，参考王永力[21]的方法进行体外发酵试验。称取0.4 g青贮饲料样品装入尼龙袋并放于升温至39 ℃的发酵瓶中，然后加入30 mL的培养液，再向发酵瓶中通入CO2气体至饱和，封口后在39 ℃恒温培养箱中培养48 h，每个处理设3个重复，1个空白对照。测定发酵各时间点(2、4、8、12、24、36、48 h)的产气量(gas production，GP)。在瘤胃体外发酵48 h结束后，取出尼龙袋，并用蒸馏水冲洗干净，放置于105 ℃烘箱中干燥3 h，测定DM、CP、NDF和ADF残留量，后分别计算出体外干物质消化率(in vitro dry matter digestibility，IVDMD)、体外粗蛋白消化率(in vitro crude protein digestibility，IVCPD)、体外中性洗涤纤维消化率(in vitro neutral detergent fibre digestibility，IVNDFD)和体外酸性洗涤纤维消化率(in vitro acid detergent fibre digestibility，IVADFD)。剩余发酵液参考张艳玲和张力莉[22]方法测定微生物蛋白(microbial crude protein，MCP)。
产气动力学模型[23]如下：
$$ GPt = A \times \left\{ {1 - {{\exp }^{\left[ { - c \times \left ( {t - Lag} \right)} \right]}}} \right\} 。 $$ 式中：GPt为在t时刻的累积产气量(mL·g−1)，A为理论最大产气量(mL)，c为产气速率常数(mL·h−1)，t为产气时间(h)，Lag为产气延滞时间(h)。
平均产气速率(average gas production rate，AGPR)的计算[24]公式如下：
$$ AGPR = \dfrac{{A \times {{c}}}}{{{\text{2}} \times \left ( {\ln 2 + c \times Lag} \right)}} 。 $$ 1.4 数据分析
利用Excel 2016进行数据的初步处理，然后用SPSS 26对数据进行方差分析，通过Duncan法和T检验对测定数据进行多重比较，并利用正交多项式对比分析，对苜蓿青贮添加不同比例葡萄渣进行线性和二次曲线拟合。试验数据用平均值 ± 标准差表示，P < 0.05表示差异显著，P > 0.05表示差异不显著。图表的绘制由Origin 2021完成。
根据灰色系统理论，将DM、CP、NDF、ADF、pH、V-Score、IVDMD、IVCPD、MCP、48 h体外产气量(gas production at 48 h, GP48)、达到产气量1/2所需时间(half time)、APGR共12项指标作为一个灰色系统，使用灰色关联度分析法对青贮进行综合评价[25]。以12个指标的最理想值构成理想的参考数列：X0(k) = {X0(1), X0(2), X0(3), …, X0(n)}；以各指标的测定值构成比较数列：Xi(k) = {Xi(1), Xi(2), Xi(3), …, Xi(n)}。其中k = 1，2，3，…，n，n为测定指标数(n = 12)，i = 1，2，3，…，m，m为测定的不同青贮处理组为(m = 4)。将各指标测定值用X′i(k) = Xi(k)/X0(k)进行无量纲化处理转化为评价值，并计算与各指标之间的关联系数(ρ为分辨系数，取值介于0～1，本研究取0.5)。
关联系数[$\xi_i (k) $]：
$$ \xi_i (k) = \dfrac{{\min_i\min_ k\left| {\Delta_i (k)} \right| + \rho \max_i\max_k\left| {\Delta_i (k)} \right|}}{{\left| {\Delta_i (k)} \right| + \rho \max_i\max_k\left| {\Delta_i (k)} \right|}} 。 $$ 由于各指标对青贮品质的重要度不同，在评价不同处理的好坏时还应根据其重要程度赋予不同的权重系数，并以加权关联度对各青贮处理进行评价。根据加权关联度的大小，可评价各青贮处理的优劣。
等权关联度($ \gamma i $)：
$$ \gamma i = \dfrac{1}{n}\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^n {\xi_ i (k)} \text{；} $$ 权重系数($\omega_ i $)：
$$ \omega_ i = \dfrac{{\gamma_ i}}{{\displaystyle\sum {\gamma_ i} }} \text{；} $$ 加权关联度($\gamma_ i' $)：
$$ \gamma_ i' = \displaystyle\sum\limits_{k = i}^n {\omega_ i (k) \times \xi_ i (k)} 。 $$ 2. 结果与分析
2.1 青贮原料的营养特性
葡萄渣和苜蓿的常规营养成分及微生物数量表明，与新鲜的苜蓿原料(pH 6.00)相比，葡萄渣有着较低的pH (3.68) (表2)。葡萄渣中的DM、WSC、NDF、ADF、EE和CA含量均显著高于苜蓿(P < 0.05)，而CP和NFC含量要显著低于苜蓿(P < 0.05)；葡萄渣表面附着的乳酸菌和酵母菌数量均高于苜蓿，但表面附着的霉菌数量低于苜蓿。
表 2 青贮原料的化学成分Table 2. Chemical composition of silage materials指标
Item苜蓿
Alfalfa葡萄渣
Grape pomace干物质 Dry matter (DM)/(g·kg−1) 334.07 ± 7.00b 947.52 ± 0.58a pH 6.00 ± 0.02a 3.68 ± 0.06b 可溶性碳水化合物 Water soluble carbohydrate (WSC)/(g·kg−1) 14.06 ± 1.70b 61.80 ± 1.90a 粗蛋白 Crude protein (CP)/(g·kg−1) 156.50 ± 8.50a 130.83 ± 1.53b 粗脂肪 Ether extract (EE)/(g·kg−1) 19.50 ± 0.85b 138.13 ± 2.00a 中性洗涤纤维 Neutral detergent fiber (NDF)/(g·kg−1) 334.13 ± 5.00b 360.52 ± 2.52a 酸性洗涤纤维 Acid detergent fiber (ADF)/(g·kg−1) 271.24 ± 2.52b 286.72 ± 4.51a 粗灰分 Crude ash (CA)/(g·kg−1) 70.20 ± 1.45b 90.50 ± 1.20a 非纤维性碳水化合物 Non-fiber carbohydrate (NFC)/(g·kg−1) 420.10 ± 12.9a 280.51 ± 2.20b 乳酸菌 Lactic acid bacteria (LAB)/(log10 cfu·g−1) 3.30 ± 0.31b 5.60 ± 0.37a 酵母菌 Yeast/(log10 cfu·g−1) 6.21 ± 0.67b 10.10 ± 0.22a 霉菌 Mould/(log10 cfu·g−1) 2.53 ± 0.21 < 1.00 单宁含量 Tannin content/(g·kg−1) − 43.5 ± 0.60 同行不同小写字母表示相同指标不同原料间差异显著(P < 0.05)。“−”表示含量极低未检测出。
Different lowercase letters in the same row indicate significant differences between different silage materials at the 0.05 level; “−” indicates very low levels (not detected).2.2 葡萄渣对苜蓿青贮营养品质的影响
与对照相比，添加葡萄渣对苜蓿青贮的DM和EE影响显著(P < 0.05) (表3)；C1、C2和C3组的DM含量显著高于对照组(P < 0.05)，较对照处理分别增加了18.88%、22.02%和20.83%，但3组处理间无显著差异(P > 0.05)；C3组的CP含量显著高于对照组(P < 0.05)，提高了7.73%；添加葡萄渣对苜蓿青贮的NDF、ADF、CA和NFC含量没有显著影响(P > 0.05)。此外，随着葡萄渣比例的增加，苜蓿混合青贮的DM和EE呈线性升高(P < 0.05)，同时，也存在显著的二次曲线效应(P < 0.05)。
表 3 葡萄渣对苜蓿青贮营养品质的影响Table 3. Effect of grape pomace on the nutritional quality of alfalfa silage指标 Item 处理 Treatment P 对照
ControlC1 C2 C3 组间
Group线性
Linear二次
Quadratic干物质 Dry matter (DM)/(g·kg−1) 392.00 ± 10.52b 466.00 ± 8.89a 478.33 ± 3.06a 473.67 ± 6.66a < 0.01 < 0.01 < 0.01 粗蛋白 Crude protein (CP)/(g·kg−1) 151.00 ± 2.65b 161.33 ± 2.08ab 157.33 ± 9.71ab 162.67 ± 4.04a 0.12 0.06 0.46 中性洗涤纤维
Neutral detergent fiber (NDF)/(g·kg−1)354.67 ± 11.21 353.67 ± 7.37 351.67 ± 3.51 353.67 ± 8.33 0.97 0.82 0.76 酸性洗涤纤维
Acid detergent fiber (ADF)/(g·kg−1)285.00 ± 8.54 284.00 ± 7.55 282.33 ± 9.02 283.33 ± 8.08 0.98 0.76 0.84 粗灰分 Crude ash (CA)/(g·kg−1) 100.80 ± 2.31 94.33 ± 4.66 103.50 ± 8.26 100.33 ± 7.54 0.38 0.64 0.66 粗脂肪 Ether extract (EE)/(g·kg−1) 22.91 ± 0.67c 72.50 ± 3.90b 74.17 ± 2.61ab 78.10 ± 2.20a < 0.01 < 0.01 < 0.01 非纤维性碳水化合物
Non-fiber carbohydrate (NFC)/(g·kg−1)305.20 ± 13.12 318.17 ± 13.22 313.33 ± 17.80 305.23 ± 21.91 0.97 0.92 0.31 同行不同小写字母表示相同指标不同处理间差异显著(P < 0.05)；C1：添加100 g·kg−1葡萄渣；C2：添加150 g·kg−1葡萄渣；C3：添加200 g·kg−1葡萄渣。下表同。
Different lowercase letters in the same row indicate significant difference between different treatment at the 0.05 level; C1: addition of 100 g·kg−1 grape pomace, C2: addition of 150 g·kg−1 grape pomace, C3: addition of 200 g·kg−1 grape pomace. This is applicable for the following tables as well.2.3 葡萄渣对苜蓿青贮发酵品质的影响
苜蓿单独青贮时pH为5.06 (表4)，添加葡萄渣混合青贮处理的pH均降至4.52以下，其中C3组的pH最低，为4.16；对照组的NH3-N含量显著高于其他处理组(P < 0.05)；C3组的LA含量最高，AA含量最低，均显著高于或低于其他处理(P < 0.05)；C3组的PA含量显著低于对照组和C1组(P < 0.05)，与C2组无显著差异(P > 0.05)；4个处理组中仅对照组检测出了极少量的BA含量，其他3个处理均没有BA产生。在V-Score评分体系中对照组的得分为87.92分，其余3个处理组评分均大于等于90分。此外，随着葡萄渣比例的增加，苜蓿混合青贮的pH、AA、PA、和NH3-N呈线性下降(P < 0.05)，LA和V-Score得分呈线性升高(P < 0.05)，其中除V-Score得分以外都存在显著的二次曲线效应(P < 0.05)。
表 4 葡萄渣对苜蓿青贮发酵品质的影响Table 4. Effect of grape pomace on the fermentation quality of alfalfa silage指标
Item处理 Treatment P 对照
ControlC1 C2 C3 组间
Group线性
Linear二次
QuadraticpH 5.06 ± 0.05a 4.52 ± 0.04b 4.43 ± 0.07b 4.16 ± 0.05c < 0.01 < 0.01 < 0.01 乳酸 Lactic acid (LA)/(g·kg−1) 23.37 ± 0.95d 41.20 ± 1.95c 50.07 ± 1.31b 56.53 ± 0.91a < 0.01 < 0.01 < 0.01 乙酸 Acetic acid (AA)/(g·kg−1) 34.77 ± 1.67a 23.27 ± 1.77b 16.30 ± 0.92c 11.80 ± 0.90d < 0.01 < 0.01 < 0.01 丙酸 Propionic acid (PA)/(g·kg−1) 0.84 ± 0.08a 0.37 ± 0.05b 0.28 ± 0.03bc 0.22 ± 0.04c < 0.01 < 0.01 < 0.01 丁酸 Butyric acid (BA)/(g·kg−1) 0.05 ± 0.02 − − − < 0.01 < 0.01 < 0.01 氨态氮 NH3-N/(g·kg−1) 58.40 ± 1.81a 32.70 ± 0.35b 24.27 ± 0.96c 18.30 ± 1.25d < 0.01 < 0.01 < 0.01 V-Score 87.92 ± 0.52c 90.00 ± 0.00b 90.00 ± 0.00b 92.29 ± 0.67a < 0.01 < 0.01 0.68 2.4 葡萄渣对苜蓿青贮体外消化pH和氨态氮及微生物蛋白的影响
随着葡萄渣添加量增加，pH呈逐渐降低的趋势(表5)。C3组pH最低，但与其他各处理间无显著差异(P > 0.05)；体外发酵48 h，C2组的MCP含量显著高于其他3个处理(P < 0.05)，NH3-N含量显著高于对照和C1组(P < 0.05)，与C3组差异不显著(P > 0.05)；C3组的MCP含量显著低于其他3个处理(P < 0.05)。此外，随着葡萄渣比例的增加，苜蓿混合青贮体外消化NH3-N和MCP呈线性升高(P < 0.05)，其中，MCP存在显著的二次曲线效应(P < 0.05)。
表 5 葡萄渣对苜蓿青贮体外消化pH、氨态氮及微生物蛋白的影响Table 5. Effect of grape pomace on the in vitro digestion of pH, ammonia nitrogen, and microbial protein of alfalfa silage指标
Item处理 Treatment P 对照
ControlC1 C2 C3 组间
Group线性
Linear二次
QuadraticpH 6.58 ± 0.07 6.56 ± 0.05 6.54 ± 0.04 6.52 ± 0.04 0.47 0.14 0.86 氨态氮
NH3-N/(mg·mL−1)0.13 ± 0.00b 0.13 ± 0.00b 0.14 ± 0.00a 0.14 ± 0.00ab 0.03 0.02 0.54 微生物蛋白
Microbial crude protein (MCP)/(mg·mL−1)0.53 ± 0.00b 0.53 ± 0.00b 0.54 ± 0.00a 0.49 ± 0.00c < 0.01 < 0.01 < 0.01 2.5 葡萄渣对苜蓿青贮体外产气量和体外消化率的影响
4个处理组的累计产气量随着体外发酵时间的增加而增加(图1)，在发酵初期增长速度最快，后期逐渐缓慢；48 h的GP排序为C2 > C3 > C1 > 对照组。
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图 1 葡萄渣对苜蓿青贮体外发酵48 h的产气动态曲线Figure 1. Dynamics of gas production from grape pomace on alfalfa silage fermented in vitro for 48 hC2组的IVDMD显著高于其他3个处理(P < 0.05) (表6)；IVCPD显著高于对照组和C1组；C3组的IVNDFD显著高于对照组，与C1组和C2组无显著差异(P > 0.05)；4个处理的IVADFD无显著差异。产气参数方面，向苜蓿青贮中添加葡萄渣均可显著增加A、c和AGPR (P < 0.05)，同时显著降低Half time (P < 0.05), C2组的A、c和AGPR显著高于其他3个处理，Half time显著低于其他3个处理(P < 0.05)。此外，随着葡萄渣比例的增加，苜蓿混合青贮IVDMD、IVCPD、GP48、A、c和AGPR都呈线性升高(P < 0.05)，并且IVDMD、GP48、A、c和AGPR存在显著的二次曲线效应(P < 0.05)。
表 6 葡萄渣对苜蓿青贮48 h体外消化率和产气参数的影响Table 6. Effect of grape pomace on 48 h in vitro digestibility and gas production parameters of alfalfa silage指标
Item处理 Treatment P 对照
ControlC1 C2 C3 组间
Group线性
Linear二次
Quadratic体外干物质消化率
In vitro dry matter digestibility (IVDMD)/%62.70 ± 0.40b 62.60 ± 0.26b 65.60 ± 0.70a 63.33 ± 0.71b < 0.01 < 0.01 < 0.01 体外粗蛋白消化率
In vitro crude protein digestibility (IVCPD)/%0.50 ± 0.02c 0.54 ± 0.02b 0.57 ± 0.01a 0.55 ± 0.01ab < 0.01 < 0.01 0.02 体外中性洗涤纤维消化率
In vitro neutral detergent fibre digestibility (IVNDFD)/%0.50 ± 0.01b 0.51 ± 0.00ab 0.51 ± 0.00ab 0.52 ± 0.01a 0.08 0.03 0.26 体外酸性洗涤纤维消化率
In vitro acid detergent fibre digestibility (IVADFD)/%0.29 ± 0.02 0.30 ± 0.01 0.30 ± 0.02 0.29 ± 0.02 0.93 0.93 0.56 48 h体外产气量
Gas production at 48 h (GP48)/(mL·g−1)85.13 ± 0.31c 86.80 ± 0.56b 88.77 ± 0.31a 87.40 ± 1.05b < 0.01 < 0.01 < 0.01 理论最大产气量
Asymptotic gas production (A)/mL85.14 ± 0.31c 86.79 ± 0.59b 88.79 ± 0.31a 87.39 ± 1.05b < 0.01 < 0.01 < 0.01 产气速率
Rate of gas production (c)/(mL·h−1)0.45 ± 0.00c 0.46 ± 0.00b 0.47 ± 0.00a 0.46 ± 0.01b < 0.01 < 0.01 < 0.01 产气延滞时间
The time delay to the start of gas production (Lag)/h0.01 ± 0.00 0.01 ± 0.00 0.01 ± 0.00 0.01 ± 0.00 达到产气量1/2所需时间
Half time/h3.96 ± 0.07a 3.65 ± 0.12b 3.33 ± 0.09c 3.64 ± 0.08b < 0.01 < 0.01 < 0.01 平均产气速率
Average gas production rate (AGPR)/(mL·h−1)27.44 ± 0.19c 28.53 ± 0.41b 29.86 ± 0.20a 28.94 ± 0.72b < 0.01 < 0.01 < 0.01 2.6 不同处理下青贮评价指标的加权关联度和排序结果
对4个处理12个指标的加权关联度值进行排序得出，将葡萄渣与苜蓿进行混合青贮后，青贮饲料综合品质由高到低依次是C2 > C3 > C1 > 对照组(表7)。
表 7 不同处理下青贮评价指标的加权关联度和排序结果Table 7. Weighted correlations and ranking results of silage evaluation indicators under different treatments处理
Treatment加权关联度
Weighted incidence degree综合排序
Comprehensive rankingC2 0.9374 Ⅰ C3 0.8489 Ⅱ C1 0.7904 Ⅲ 对照 Control 0.6519 Ⅳ 3. 讨论
3.1 葡萄渣对苜蓿青贮营养品质的影响
CP含量是评估青贮饲料营养品质的重要指标之一，CP含量越高表明青贮的饲用价值越高[26]，在本研究中，添加200 g·kg−1 葡萄渣的苜蓿青贮CP含量显著高于苜蓿单独青贮，这可能是葡萄渣中的缩合单宁抑制了蛋白水解酶的活性，从而降低了苜蓿青贮蛋白水解的程度，提高了CP含量[12]。
研究表明，NDF和ADF的含量分别与动物的采食量和消化率负相关，是判断饲料中纤维好坏的重要标准[27]。在本研究中，添加葡萄渣苜蓿混合青贮的NDF和ADF含量均低于对照组，这可能与葡萄渣中含有脲酶有关，在青贮发酵前期，葡萄渣中的脲酶能在青贮中产生氨，氨又与水结合成氨水，氨水电离出的氢氧根离子可以断裂木质素和纤维素之间的酯键，溶解半纤维素和部分木质素，从而降低NDF和ADF的含量[28]。
3.2 葡萄渣对苜蓿青贮发酵品质的影响
青贮饲料中pH、NH3-N和有机酸的含量是评价青贮发酵品质的关键指标[29]。在青贮饲料中，pH越低，表明青贮发酵品质越好，当青贮饲料pH低于4.2时视为发酵良好[30]。在本研究中，向苜蓿青贮中添加不同量的葡萄渣，能使混合青贮pH显著下降，并能提高混合青贮的LA含量，这与柯文灿等[31]研究结果一致。葡萄渣中的单宁有着抑菌活性，在低pH环境下其抑菌性更强，而LAB可以耐受更低的pH，从而成为青贮发酵中的主导菌群[32]。本研究中，添加葡萄渣处理组青贮LA含量显著高于苜蓿单独青贮处理组，其中C3组的pH最低，LA含量最高，与上述研究结果一致。
V-Score青贮发酵品质评价系统是利用青贮中有机酸和NH3-N的含量来反映青贮的发酵品质，一般品质较好的青贮饲料中BA和NH3-N含量应分别低于0.1%和10% [33]，在青贮饲料中NH3-N含量越高表明蛋白质的降解越严重，从而直接影响到动物的采食量和饲草利用率[34]，在本研究中各处理的BA和NH3-N含量均分别低于0.1%和0.14 mg·mL−1，V-Score评分也均高于80分，都达到良好等级以上，且添加200 g·kg−1葡萄渣的苜蓿混合青贮评分最高，为92.29分。其中添加葡萄渣处理组的NH3-N含量显著低于对照组，这可能与葡萄渣原料自身附着较多乳酸菌有关，乳酸菌可促进LA的发酵进程，快速降低pH，抑制蛋白质水解，降低NH3-N含量。
3.3 葡萄渣对苜蓿青贮体外消化特征的影响
瘤胃内pH是反映瘤胃发酵水平的一个综合性指标，瘤胃pH一般介于5.5～7.5 [35]，当pH不在此范围内，无论过高或过低都会影响瘤胃内微生物的活性，从而影响到瘤胃的发酵性能。本研究各处理组的瘤胃pH均介于6.52～6.58，适合瘤胃微生物的生长和瘤胃发酵，瘤胃pH与前人研究适合瘤胃消化纤维和干物质的最适pH (6.5)相同[36]。本研究结果表明葡萄渣苜蓿混合青贮在瘤胃内发酵效果良好，对瘤胃内发酵环境无不利影响，适合瘤胃发酵。
瘤胃NH3-N含量可以反映青贮中蛋白质在瘤胃中的消化情况[37]，影响着MCP的合成，MCP的合成需要瘤胃NH3-N维持在适宜的含量范围内[38]，本研究的NH3-N含量介于0.13～0.14 mg·mL−1，与韩正康和陈杰[39]研究的瘤胃内NH3-N含量应该在0.1～0.5 mg·mL−1范围的结果一致。在本研究中随着葡萄渣的加入，NH3-N含量也有着增加的趋势，这可能与葡萄渣本身蛋白含量较高有关。
反刍动物瘤胃内的厌氧微生物可以将蛋白质水解为游离氨基酸、小肽和氨，并以挥发性脂肪酸和二氧化碳为碳架生成MCP，因此MCP含量的多少，也可反映瘤胃发酵的好坏[40]。葡萄渣富含缩合单宁，有研究表明在奶牛日粮中添加缩合单宁会降低MCP的合成效率[41]，在本研究中，C2组的MCP含量最高，并且显著高于对照组，表明合适的葡萄渣添加量可以提高苜蓿青贮发酵液中MCP的含量，这与张艳玲和张力莉[22]等结果一致。
GP与瘤胃降解率有着密切的关系，GP的多少能够直观反映饲料在瘤胃中的降解程度[42]。而GP与产气速率成正比，产气速率越快，累计产气量越高，从而饲料的消化率就越高，表明饲料中可利用的营养成分也就越多。张力莉等[43]研究表明，随着葡萄残渣添加量的增加，GP也不断上升，与本研究结果一致。在本研究中，添加葡萄渣苜蓿青贮组的GP48、A、c和AGPR均显著高于对照组。IVDMD的高低，可以反映饲料在反刍动物体内消化的难易程度[44]。IVDMD越高，表明饲料品质越好。在本研究中C2组显著提高了苜蓿青贮IVDMD和IVCPD，这可能是添加葡萄渣后，苜蓿混合青贮营养品质提升，促使瘤胃微生物活动增加，从而提高了降解率，也可能是葡萄渣中缩合单宁抑制了有害微生物的生长，从而抑制了蛋白质的水解，减少了植物细胞内容物的损失，保留了营养物质，从而提高了IVDMD和IVCPD。结果表明，在苜蓿青贮中添加一定含量的葡萄渣可以提高苜蓿青贮的消化效率。
4. 结论
向苜蓿青贮中添加葡萄渣可显著降低青贮饲料的pH、NH3-N含量，提高了V-Score评分、CP和LA含量，提升DM和CP体外消化率。同时增加体外产气量，改善体外消化率。其中以添加150 g·kg−1葡萄渣与苜蓿进行混合青贮效果最佳。
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图 1 不同处理土壤pH、有机质、全量和速效养分含量
不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05)。
Figure 1. Soil pH, organic matter, total and available nutrients of the treatments
Different lowercase letters indicate significant difference between treatments at the 0.05 level.
表 1 试验设计
Table 1 Experimental design
处理
Treatment建植时间
The year of planting种床组成
Seed bed composition坡度
Slope播种方法
Sowing methodZC11 2021 渣土 Dump 平地 Flat land ①→④→⑤ ZC12 2021 渣土 ꞉ 羊板粪 = 5 ꞉ 1
Dump ꞉ sheep manure = 5 ꞉ 1平地
Flat land①→②→④→⑤ ZC13 2021 渣土，施有机肥
Dump, application of organic fertilizer
(12 000 kg·hm−2)平地
Flat land①→③→⑤ ZC14 2021 渣土 ꞉ 羊板粪 = 5 ꞉ 1，施有机肥
Dump ꞉ sheep manure = 5 ꞉ 1, application
of organic fertilizer (15 000 kg·hm−2)30°坡地
30° Slope land①→②→③→⑤ ZC15 2021 渣土 ꞉ 羊板粪 = 5 ꞉ 1，施有机肥
Dump ꞉ sheep manure = 5 ꞉ 1, application
of organic fertilizer (11 250 kg·hm−2)平地
Flat land①→②→③→⑤ BP61 2016 渣土 Dump 路边45°坡地 Roadside 45° slope ①→④→⑤ BP62 2016 渣土 Dump 路边30°坡地 Roadside 30° slope ①→④→⑤ ZC61 2016 渣土 Dump 平地 Flat land ①→④→⑤ ZC62 2016 渣土，追肥 Dump, topdressing 平地 Flat land ①→④→⑤ ① 挑选出矿土中大于5 cm的石粒(至少30 cm深)；② 如施羊板粪，先在上述矿土表层铺设羊板粪 5 cm，用旋耕机旋深30 cm，将渣土和羊板粪混匀；③ 如施颗粒有机肥，先将有机肥总用量的60%撒在筛选过的表层，用旋耕机旋深5 cm混匀，剩余40%的有机肥与牧草专用肥和种子一起撒播； ④ 将 255 kg·hm−2牧草专用肥 (NPK 复合肥) 和种子一起播种；⑤ 轻耙耱平，使种子埋入表层土壤中，铺设无纺布，边缘用石头覆压。
① The stone grains larger than 5 cm (to less than 30 cm deep) in the ore soil were selected; ② If sheep board manure is applied, first lay sheep board manure 5 cm on the surface of the mineral soil, use the rotary tiller to spin 30 cm deep, mix the muck and sheep board manure; ③ If the grain fertilizer is applied, 60% of the total use of fertilizer is scattered on the surface of the selected surface, and the rotary cultivator is used to mix the manure with a depth of 5 cm, and the remaining 40% of organic fertilizer is sown with the special forage fertilizer and seeds; ④ 255 kg·hm−2 pasture fertilizer (NPK compound fertilizer) was sown with the seeds; ⑤ The utility model uses a light rake for burying the seeds in the surface soil, laying a non-woven cloth and covering the edge with a stone.
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表 2 不同种草处理的植物种类和生物结皮盖度
Table 2 Plant species, soil biological crust species, and coverage of grass-planting treatments
处理
Treatment植物种类
Plant species生物结皮种类
Soil biological
crust species生物结皮盖度
Soil biological crust coverage/%ZC11 短芒披碱草、小花碱茅、中华羊茅、冷地早熟禾、草地早熟禾
Elymus breviaristatus, Puccinellia tenuiflora,
Festuca sinensis, Poa crymophila, Poa pratensisZC12 短芒披碱草、小花碱茅、中华羊茅、冷地早熟禾、草地早熟禾、灰绿藜
Elymus breviaristatus, Puccinellia tenuiflora, Festuca sinensis, Poa crymophila, Poa pratensis, Chenopodium glaucumZC13 短芒披碱草、小花碱茅、中华羊茅、冷地早熟禾、草地早熟禾
Elymus breviaristatus,Puccinellia tenuiflora,
Festuca sinensis, Poa crymophila, Poa pratensisZC14 短芒披碱草、小花碱茅、中华羊茅、冷地早熟禾、草地早熟禾
Elymus breviaristatus, Puccinellia tenuiflora,
Festuca sinensis, Poa crymophila, Poa pratensisZC15 短芒披碱草、小花碱茅、中华羊茅、冷地早熟禾、草地早熟禾
Elymus breviaristatus, Puccinellia tenuiflora,
Festuca sinensis, Poa crymophila, Poa pratensisBP61 短芒披碱草、甘肃马先蒿
Elymus breviaristatus, Pedicularis kansuensisBP62 短芒披碱草、草地早熟禾、甘肃马苋蒿
Elymus breviaristatus, Poa pratensis, Pedicularis kansuensis苔藓、地衣
Moss and lichen25 ZC61 短芒披碱草、草地早熟禾、甘肃马苋蒿
Elymus breviaristatus, Poa pratensis, Pedicularis kansuensis苔藓 Moss 3 ZC62 短芒披碱草、草地早熟禾、甘肃马苋蒿
Elymus breviaristatus, Poa pratensis, Pedicularis kansuensis苔藓 Moss 3 TR1 草地早熟禾、甘肃马苋蒿、中华羊茅、青藏龙胆、火绒草、青藏薹草、垂穗披碱草、藏嵩草
Poa pratensis, Pedicularis kansuensis, Festuca sinensis, Gentiana futtereri, Leontopodium leontopodioides,
Carex moorcroftii, Elymus nutans, Koeleria tibetica苔藓、地衣
Moss and lichen20 TR2 青藏薹草、双柱头藨草
Carex moorcroftii, Scirpus distigmaticus处理编号参见表1；下同。
The treatment codes are given in Table 1; this is applicable to the following tables and figures as well.
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表 3 植物群落特征
Table 3 Vegetation characteristics of individual plots
处理
Treatment盖度
Coverage/%草层高度
Grass height/cm密度
Density/(× 104 plants·m−2)地上生物量
Aboveground biomass/(g·m−2)ZC11 50.00 ± 5.40d 13.10 ± 1.60g 0.655 ± 0.012e 96.60 ± 20.60f ZC12 93.00 ± 6.10a 27.20 ± 3.30d 1.022 ± 0.032c 338.40 ± 24.70c ZC13 85.00 ± 3.20b 16.50 ± 1.60f 1.101 ± 0.041c 386.10 ± 20.20b ZC14 82.00 ± 4.60b 15.80 ± 2.10gf 1.153 ± 0.121b 409.40 ± 16.40b ZC15 90.00 ± 4.80a 17.50 ± 2.20f 1.431 ± 0.210a 470.20 ± 15.10a BP61 8.00 ± 1.30e 49.60 ± 3.60b 0.003 ± 0.001h 33.40 ± 2.50g BP62 15.00 ± 4.20d 44.20 ± 3.70c 0.018 ± 0.002g 123.90 ± 16.40f ZC61 20.00 ± 5.30d 48.00 ± 2.10b 0.021 ± 0.003g 121.60 ± 19.80f ZC62 88.00 ± 6.30ab 53.80 ± 3.50a 0.132 ± 0.031f 395.10 ± 13.60b TR1 70.00 ± 5.80c 20.30 ± 3.10e 0.108 ± 0.012f 257.00 ± 12.80d TR2 90.00 ± 4.10a 30.20 ± 3.50d 0.840 ± 0.052d 189.90 ± 13.90e 同列数不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05)。
Different lowercase letters within the same column indicate significant difference between treatments at the 0.05 level.
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表 4 植物群落特征和土壤肥力指标的相关性
Table 4 Correlation between plant community characteristics and soil fertility index
指标
ParameterpH 有机质
Organic
matter全氮
Total
nitrogen全磷
Total
phosphorus全钾
Total
potassium速效氮
Available
nitrogen速效磷
Available
phosphorus速效钾
Available
nitrogen盖度 Coverage 0.321 0.362 0.417 0.101 0.102 0.179 0.332 0.535 密度 Density 0.032 0.003 0.615* 0.219 0.322 0.175 0.171 0.614* 高度 Grass height −0.005 −0.047 −0.329 0.242 0.051 0.051 0.222 −0.192 生物量
Aboveground biomass0.410 0.362 0.626* 0.230 0.110 0.443 0.538 0.822** *、**分别表示显著(P < 0.05)、极显著(P < 0.01)相关性。
* and ** indicate significant correlation at 0.05 and 0.01 levels, respectively.
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