箭筈豌豆(Vicia sativa)是重要的一年生自花授粉豆科牧草，常被用作青饲、干草、绿肥等，也可用于生产甲烷生物燃料和保健食品^[1-3]，在中国、中亚、南美等地区广泛种植^[4]。优异的耐寒性和较高的经济价值，使其成为高寒牧区的重要豆科饲草。

低温是高寒牧区植物生长的重要环境胁迫因子之一，严重影响作物产量，威胁农牧业生产安全^[5]。箭筈豌豆受到低温胁迫后体内防御活性氧的酶促和非酶促保护系统能力下降，细胞内自由基水平升高，加剧了膜脂过氧化作用，引起质膜损伤，最终形成低温伤害^[6]。植物经过冷驯化后丙二醛含量降低，可溶性糖含量、超氧化物歧化酶、过氧化物酶等酶活性能够得到提升，从而提高植物的抗冻性 ^[7-10]。未进行低温驯化的拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株叶片在5 ℃下暴露于强光会导致光系统Ⅱ (PSⅡ)和光系统Ⅰ (PSⅠ)光化学效率降低45%和35%，而经过冷驯化(CA)叶片的PSⅡ和PSⅠ光化学效率仅分别减少35%和22% ^[11]。植物经过冷驯化后能够较好的适应寒冷环境，提高存活率，如黑麦(Secale cereale) ^[12]、北美杜鹃(Rhododendron canadense) ^[13]、小麦(Triticum aestivum) ^[14]、西番莲(Passiflora edulis) ^[15]等研究。目前，冷驯化机制的研究主要集中于模式植物拟南芥及谷物类粮食作物，对箭筈豌豆冷驯化的研究鲜有报道。

本研究选用箭筈豌豆品种‘兰箭1号’和‘兰箭3号’，对不同冷驯化温度、不同驯化时间下箭筈豌豆幼苗叶片叶绿素荧光、抗氧化酶活性、渗透调节物质变化及冷响应基因表达情况进行研究，探究利用冷驯化提高箭筈豌豆抗低温能力的可行性，以期为高寒牧区箭筈豌豆抗寒品种选育提供基础数据。

1.   材料和方法

1.1   植物材料

供试材料为箭筈豌豆栽培品种‘兰箭1号’和‘兰箭3号’，由兰州大学草地农业科技学院提供。

1.2   试验设计

试验于贵州大学西校区动物科学学院进行，采用水培法。于2019年12月将箭筈豌豆种子用1.0% (V∶V)次氯酸钠表面消毒5 min，蒸馏水冲洗5遍，置于人工气候箱25 ℃避光萌发3 d，挑选发芽一致种子在半浓度的霍格兰营养液(1/2 Hoagland’s，pH 6.0)中水培，光照条件为16 h/8 h (光/暗)，相对湿度70%，处理期间每2 d换1次营养液。

待幼苗生长1周后，将长势一致的植株统一NA处理1周备用，备用植株一部分置于4 ℃进行6 h的CS处理并采样，另一部分NA处理后直接依次连续进行10 ℃下持续7 d的CA处理，4 ℃下持续6 h的CAS处理，4 ℃下持续7 d的FA处理和25 ℃/20 ℃ (白天/夜晚)下持续7 d的DA处理，所有处理均为16 h/8 h (白天/夜晚)，具体处理条件如表1所列，在每个处理结束后立即取样。每次处理后，收集紧邻顶芽的第二叶和向下的第三叶，并立即在液氮中冷冻，接着储存在−80 ℃保存备用。每个处理设置3个重复，每个重复60个单株。

表  1  试验处理

Table  1.  Experimental treatment

处理 Treatment	编号 Mark	温度 Temperature/℃	时间 Time
对照组 No acclimation	NA	25	7 d
冷刺激 Cold stimulus	CS	4	6 h
冷驯化 Cold acclimation	CA	10	7 d
冷驯化后冷刺激 Cold stimulus after cold acclimation	CAS	4	6 h
冷处理 Chilling acclimation	FA	4	7 d
冷恢复 De-acclimation	DA	25/20	7 d

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1.3   叶绿素荧光F_v/F_m测定

‘兰箭1号’和‘兰箭3号’对照组NA置于25 ℃下3周。处理组置于NA组1周后进行CA处理1周，再置于FA处理1周。测定NA组和FA组叶绿素荧光F_v/F_m值^[16] (叶绿素荧光成像仪，捷克PSI/PSI，型号：Fluor Cam)。

1.4   生理指标测定

丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法测定^[17]，可溶性糖(SS)含量采用蒽酮比色法测定^[17]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑法测定^[17]，过氧化氢酶(CAT)活性采用愈创木酚比色法测定^[18]。

1.5   低温响应相关基因表达量测定

选择前期获得的4个箭筈豌豆低温响应差异表达基因，如表2所列。

表  2  4个冷响应相关基因信息

Table  2.  Information on four cold tolerance genes

基因ID Gene ID	基因名称 Gene name	KEGG描述 KEGG Description
c69213.graph_c0	AHP1 Asp-to-His 1	含组氨酸磷酸转移蛋白 Histidine-containing phosphotransfer protein
c79003.graph_c0	LHCA5 Light-harvesting chlorophyll, ab-binding 5	光系统 I 叶绿素 a/b 结合蛋白 5 Light-harvesting complex I chlorophyll A/B-binding protein
c83319.graph_c0	IAA14 Acetic acid inducible 14	生长素反应蛋白 IAA14 Auxin-responsive protein IAA14
c90796.graph_c0	FNR Ferredoxin-NADP + oxidoreductase	叶铁氧还蛋白-NADP 还原酶 Leaf ferredoxin-NADP reductase

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使用Premier 5设计qRT-PCR引物(表3)，生工生物技术(中国上海)合成。qRT-PCR反应使用2 × SG Fast qPCR Master Mix (Sangon Biotech)在CFX96 Touch™ RealTime PCR检测系统(Bio-Rad，美国)上进行。PCR扩增反应程序如下：95 ℃ 3 min，45个循环，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s。将在箭筈豌豆转录组表达谱中表现相对稳定的基因Unigene 68614选为内参基因，箭筈豌豆转录组数据为课题组前期获得。计算相对表达水平公式如下：FC = 2^−△△CT ^[19]，其中FC是指变化的倍数，^△△CT是指目的基因在处理组中相对于对照组的表达差异。

表  3  引物列表

Table  3.  List of primers used in this study

基因名称 Gene name	上游序列 5′ – 3′ Forward Sequence 5′ – 3′	下游序列 5′ – 3′ Reverse Sequence 5′ – 3′
AHP1	TGCTTTCCGCAACTTCTGTGAGG	AGCTGCAACTATCTGCTGCTCAAG
LHCA5	CGTCGCAGGAGTTAGCACCATAC	GCAACGAGCGTCCCTGTGTTC
IAA14	TTGGCAGGGTCCTTAAGCATGTTC	GGCGGCGAGGTTGAAACTCC
FNR	GGTGTCACTCGCTGCCAAAGAC	TCGACATTCCATTGTTCCGCCTTC
Unigene68614	GCTAAAGCATTGAACAACAAAAGA	GCAAAGTTTGTCCCTTCACC

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1.6   统计方法

生理指标和qRT-PCR数据均使用Excel 2013进行处理，应用SPSS 19.1进行单因素方差分析，使用Duncan法进行多重比较。

2.   结果与分析

2.1   箭筈豌豆幼苗对冷驯化的响应

2.1.1   叶绿素荧光值

叶绿素荧光F_v/F_m值在NA组中‘兰箭3号’显著大于‘兰箭1号’(P < 0.05)，分别为0.737和0.704 (图1)；与NA相比，经过FA处理后，F_v/F_m值显著下降，其中‘兰箭3号’显著高于‘兰箭1号’，分别为0.516和0.371。

图  1  冷胁迫下两种箭筈豌豆的叶绿素荧光值F_v/F_m值

NA：25 ℃常温不处理；FA：7 d 4 ℃长期处理。不同大写字母表示同一胁迫处理不同种质间差异显著 (P < 0.05)，不同小写字母表示同一种质不同胁迫处理间差异显著(P < 0.05)；下图同。

Figure  1.  Chlorophyll fluorescence F_v/F_m value of two common vetches under cold stress

NA: no acclimation; FA: a 7-day long-term freezing acclimation. Different capital letters for the same stress treatments indicate a significant difference between different germplasms at the 0.05 level; different lowercase letters for the same germplasm indicate a significant difference between different stress treatments at the 0.05 level. This is applicable for the following figures as well.

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2.1.2   丙二醛含量

‘兰箭1号’和‘兰箭3号’的MDA含量在CS处理组中最高，分别为59.80和91.26 μmol·g⁻¹ (图2A)。随着处理时间的增加和处理温度的降低MDA含量较CS均下降，受到低温胁迫后MDA含量总体表现为‘兰箭3号’显著大于‘兰箭1号’(P < 0.05)。

图  2  冷胁迫对箭筈豌豆生理指标的影响

处理编号参见表1。

Figure  2.  Effect of cold stress on physiological indicators of common vetch

The code of treatments refor to Table 1.

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2.1.3   可溶性糖含量

冷驯化处理前后两个品种的SS含量均发生了显著变化(图2B)。‘兰箭1号’在处理期呈升高趋势，在CA处理达到峰值后下降，接着再次上升。DA组显著高于NA (P < 0.05)，分别为41.93和25.63 μmol·g⁻¹。‘兰箭3号’呈现不断降低的趋势(CAS处较CA略微上升)，FA处理组和DA处理组与NA对比分别下降了36.86和47.43 μmol·g⁻¹。

2.1.4   超氧化物歧化酶活性

经过不同冷驯化处理，CA、FA和DA组‘兰箭1号’ SOD活性显著高于NA组(P < 0.05)，DA组最高，为257.77 μmol·g⁻¹ (图2C)。‘兰箭3号’冷处理组均显著高于NA组(P < 0.05)；FA组最高，为235.10 μmol·g⁻¹。

2.1.5   过氧化氢酶活性

冷驯化处理后，‘兰箭1号’ CAT含量除CAS组上升，其余均下降，最高值出现在CAS组(P < 0.05)，最低值出现在DA组，分别为23.37和15.68 μmol·g⁻¹。‘兰箭3号’在 处理初期呈现升高趋势，在CA处理时达到峰值(38.42 μmol·g⁻¹)后迅速下降，在CAS处理达到最低(11.74 μmol·g⁻¹) (图2D)。

2.2   冷响应基因表达模式

2.2.1   AHP1基因表达模式

不同冷驯化条件下，AHP1基因表达量在两个品种中均在CS组中最低，‘兰箭1号’和‘兰箭3号’分别为76.42和76.85 (图3A)。‘兰箭1号’中经过冷驯化环节的CAS组表达量是未经过冷驯化环节的CS组的2.17倍。‘兰箭3号’中CA组表达量最高，为154.29。

2.2.2   LCHA5基因表达模式

‘兰箭1号’ LCHA5基因在对照组NA中表达量最低，仅为150.35，处理后迅速上升，在CA处理时达到峰值，为408.9，FA处理后开始降低。‘兰箭3号’ LCHA5基因表达量在处理初期无显著变化，CA处理后开始显著上升，CAS处理达最高值，为409.22。(图3B)。

2.2.3   IAA14基因表达模式

‘兰箭1号’IAA14基因表达量在CS组最高，为190.19；最低值在DA组，仅为20.90。‘兰箭3号’各处理中IAA14基因表达量均高于‘兰箭1号’，最高值出现在DA组，为388.43 (图3C)。

2.2.4   FNR基因的表达分析

‘兰箭1号’中FNR基因表达量的最低和最高值分别出现在FA组(635.97)和CA组(1373.47)。‘兰箭3号’中DA组表达量最高，为1758.26，FA组最低，为839.03 (图3D)。

图  3  冷胁迫下AHP1 (A)、LCHA5 (B)、IAA14 (C)和FNR (D)基因的相对表达量

Figure  3.  Relative expression of AHP1 (A), LCHA5 (B), IAA14 (C), and FNR (D) genes under cold stress

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3.   讨论

3.1   低温对生理指标的影响

F_v/F_m值反映了PSⅡ原初光能转化效率，正常植物的F_v/F_m值为0.7～0.8，值越高，表明胁迫越弱，健康状况越好；值越低，表明胁迫越强，植物光合作用受到影响^[20]。本研究中，‘兰箭1号’F_v/F_m值在NA组和FA组中均显著低于‘兰箭3号’，表明‘兰箭3号’具有更高的低温耐受性。

MDA是植物细胞膜脂过氧化后的重要产物，当植物受到低温胁迫时体内MDA含量上升，可以反映植物细胞膜的过氧化程度^[21]。对水稻(Oryza sativa)的冷害研究表明，4 ℃低温处理可显著提高各品种的MDA含量，且随着处理时间的延长而增加^[22]。本研究中，不同处理条件下‘兰箭3号’MDA含量均显著大于‘兰箭1号’，表明‘兰箭1号’细胞膜防御能力要优于‘兰箭3号’。同时，冷驯化处理后的MDA比未经过冷驯化处理的低，说明不同温度的冷驯化处理均能降低两个品种的MDA含量，减弱细胞膜损伤，从而提高箭筈豌豆抗氧化能力^[23]。

植物在冷驯化期间可通过提高可溶性糖含量增加细胞液浓度，提升耐寒性^[24-26]。本研究中，‘兰箭1号’经过CA处理后SS含量显著上升，且经过冷驯化后的DA处理后SS含量仍显著高于NA，表明冷驯化可显著提升低温耐受性。‘兰箭3号’经过冷驯化后SS含量逐渐降低，可能是由于‘兰箭3号’经过冷驯化后不需要较高的SS含量来维持其渗透调节^[24]。并且‘兰箭3号’在NA、CS、CAS和FA组中SS含量均显著高于‘兰箭1号’，表明其低温耐受性仍高于‘兰箭1号’。

SOD和CAT是植物体内的保护酶体系，属于重要的活性氧自由基清除系统关键酶类^[27]。刘智成等^[28]研究发现植物可以清除因为低温胁迫而产生的过多的一些活性氧，从而保护了细胞膜结构，增加了植株抗寒能力。本研究中，经过CA和FA后，两个品种的SOD含量较NA均显著提高，表明冷驯化增强了箭筈豌豆幼苗对活性氧的清除能力，这与前人研究一致^[29]。不同处理下两个品种CAT活性的变化规律不同，‘兰箭3号’经CA处理后CAT含量显著上升，而‘兰箭1号’则在经过CAS处理后上升。说明在可耐受低温范围内，‘兰箭1号’叶片可通过调节CAT活性来提高来减少或清除活性氧，维持细胞的正常生理功能，适应低温逆境，这是植物的保护性应激反应。但抗氧化酶的防御能力是有限的，当温度低于这个可耐受温度时，细胞的组织结构会遭到破坏，进而会导致细胞内的CAT活性降^[30-31]。此外，也有研究表明，植物遭受冷胁迫时，酶促反应受到膜系统破坏的影响，造成反应的顺序和方向性错误^[32]。

3.2   低温对相关基因的影响

AHP1是酵母中过氧化物酶体生物发生条件下，受到有机过氧化物胁迫的重要过氧化物酶基因^[33]。本研究中，CA处理后AHP1基因表达量在‘兰箭1号’中降低，在‘兰箭3号’中上升，但不显著，表明AHP1基因可能不是箭筈豌豆应对低温的主效基因。

研究表明LHCA基因在植物适应环境胁迫中起着重要作用^[34]。向太和等^[35]发现光对水稻(Oryza sativa) LHCA基因具有明显的诱导促进作用。耐盐植物海蓬子(Salicornia europaea)在盐胁迫下LHCA基因表达明显上调^[36]。本研究中，经过冷驯化环节后的CAS基因表达量均显著高于CS处理组，发现冷驯化环节可诱导箭筈豌豆LHCA基因的表达，赋予其耐寒性。

IAA14作为生长素早期响应基因，其蛋白产物能够特异性结合生长素响应因子，进而调控生长素响应基因的表达，在整个植物生长素信号转导过程中具有重要作用^[37]。陈奇等^[38]研究发现不同品种的冬油菜(Brassica campestris)随着温度的降低IAA基因表达量均显著下降。百合(Lilium spp.) ^[39]、茶树(Camellia sinensis) ^[40]、薰衣草(Lavandula) ^[41]等植物遭受低温胁迫时，IAA基因均明显下调，随着胁迫时间的增加下调更加显著^[42-43]。本研究中，‘兰箭3号’在10 ℃冷驯化后IAA14表达量上升，但不显著，经4 ℃驯化后则显著降低。‘兰箭1号’在两种驯化条件下均显著降低。表明10 ℃冷驯化能够一定程度维持‘兰箭3号’在低温下生长调节。

FNR是光合电子传递过程中的关键调控基因，负责催化光合作用中电子从铁氧还蛋白传递给NADP^{+ [44]}，从而产生卡尔文循环过程中所需的还原力，此外该酶还可用于清除体内活性氧造成的氧化胁迫。部分研究表明，当温度升高时能够有效提高氧化还原酶^[45]。本研究中，冷驯化处理后其表达量上升，冷处理后下降，而CAS时期‘兰箭3号’FNR基因表达量显著上升，也说明10 ℃冷驯化能够更好地赋予箭筈豌豆低温耐受性。

4.   结论

经过冷驯化后，‘兰箭1号’和‘兰箭3号’的叶绿素荧光F_v/F_m值均有所下降；MDA含量、SOD活性、CAT活性和IAA14基因表达量均有所增加。但‘兰箭3号’在冷处理后F_v/F_m值、MDA含量、SOD活性、IAA14基因和FNR基因表达量均高于‘兰箭1号’，说明‘兰箭3号’具有更强的耐冷特性，且AHP1基因、LCHA5基因和FNR基因表达量经过冷驯化后冷刺激的箭筈豌豆均高于冷刺激组的箭筈豌豆，说明冷驯化能够增强箭筈豌豆渗透调节能力，维持较高的抗氧化能力，从而更好的帮助其抵御冷胁迫，保证正常生长发育。