添加葡萄渣对苜蓿青贮品质及体外消化特征的效果
试验以紫花苜蓿‘新牧4号’ (Medicago sativa ‘Xinmu No. 4’)和‘赤霞珠’葡萄渣为原料,分别设置对照组(苜蓿单独青贮)、C1 (添加100 g·kg−1葡萄渣)、C2 (添加150 g·kg−1葡萄渣)、C3 (添加200 g·kg−1葡萄渣) 4个处理,青贮60 d后测定各处理的发酵品质、营养成分和体外消化率等相关指标,旨在研究葡萄渣对苜蓿青贮发酵品质及体外消化率的影响。结果表明:添加葡萄渣后可增加苜蓿青贮粗蛋白和乳酸含量,提高V-Score评分,降低苜蓿青贮的pH和氨态氮含量,同时提升苜蓿青贮干物质和粗蛋白质体外消化率,起到提高苜蓿青贮饲料品质的作用。运用灰色关联度分析法进行综合评价,青贮品质由高到低依次为C2 > C3 > C1 > 对照组。综合来看,葡萄渣可改善苜蓿青贮的发酵品质和体外消化特性,苜蓿中添加150 g·kg−1的葡萄渣进行青贮效果最佳。
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新疆位于全球酿酒葡萄(Vitis vinifera)黄金种植带上,作为我国主要的优质酿酒葡萄主产区,其种植面积居全国第二,约2.34万hm2,产量居全国第一,约22.18万t,种植面积与产量均占全国总量的25%左右[1]。葡萄渣是葡萄酒酿造生产过程中的副产品,主要由葡萄皮、葡萄籽和葡萄果梗3部分构成,其产出占葡萄加工量的20%~30% [2]。当前,仅有少量的葡萄渣被回收用以花青素提取等精深加工利用,而绝大多数的葡萄渣都被用作肥料或垃圾随意堆弃。解决葡萄渣资源的循环利用,是实现葡萄酒产业可持续发展的重要现实问题。葡萄渣中有着丰富的多糖、多酚、蛋白质、油脂及矿物质等功能成分[3],将其作为反刍动物的日粮来加以利用,是提高葡萄渣利用率的重要途径。
多年生豆科牧草紫花苜蓿(Medicago sativa)是一种营养丰富、产草量高、家畜喜食的优质蛋白质饲草。新疆北疆大部分地区,在当年刈割最后一茬苜蓿时,由于气温下降等不利因素的影响,调制的苜蓿干草品质较差,将苜蓿制作成青贮饲料是解决此问题的方法之一。苜蓿青贮饲料不但营养价值高,而且可以长期保存,但苜蓿含糖量低,缓冲能高,常规青贮不易成功,且青贮过程中蛋白损失严重[4]。葡萄渣含有的缩合单宁有着多种生物活性[5-6]。单宁可以与蛋白质结合,形成单宁蛋白质复合物对蛋白质起到一定的保护作用[7];单宁还具有一定的抑菌性,在青贮饲料中添加单宁可以抑制饲料有害微生物的活性,并减少乳酸向乙酸和丁酸的转换[8]。此外,缩合单宁对反刍动物瘤胃氮代谢、微生物调控以及对反刍动物的健康和生产都有着一定的积极作用[9-11]。董文成等[12]研究发现,将葡萄渣按一定比例与苜蓿进行混合青贮,可以降低苜蓿青贮pH,改善青贮发酵品质,提高青贮有氧稳定性。也有研究报道青贮中添加葡萄渣,可快速降低青贮pH,提高青贮发酵品质和不饱和脂肪酸含量[13]。以上研究表明将葡萄渣与苜蓿进行混合青贮,即可合理的利用酿酒副产品葡萄渣,也可弥补苜蓿青贮发酵过程中的不足,但目前关于添加葡萄渣对苜蓿青贮体外消化特征的研究报道还较少。
基于此,针对苜蓿单独青贮营养损失严重,质量较差等问题,本试验以葡萄渣3种不同添加比例与苜蓿进行混合青贮,探讨葡萄渣不同添加量对苜蓿青贮营养发酵品质的影响,并利用瘤胃体外产气法结合产气动力学模型,研究葡萄渣添加对苜蓿青贮瘤胃降解利用的影响,为葡萄渣的饲料化利用提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 原料与添加剂
葡萄渣原料采自新疆中信国安葡萄酒业有限公司玛纳斯县分公司,品种为‘赤霞珠’,原料取回前已风干;苜蓿采自新疆农业大学三坪农场,为当年第3茬收获的新鲜紫花苜蓿(‘新牧4号’),切碎后待用。青贮所用的添加剂为乳酸菌、纤维分解菌等构成的复合微生物菌剂,由新疆农业科学院提供,活菌数 > 1 × 108 cfu·g−1,按青贮复合菌剂使用方法配置,装入100 mL喷壶中均匀喷洒至物料中。
1.2 青贮试验设计
本试验采用单因素完全随机设计,对照组为紫花苜蓿单独青贮;处理1组(C1)为添加100 g·kg−1 的葡萄渣;处理2组(C2)为添加150 g·kg−1 的葡萄渣;处理3组(C3)为添加200 g·kg−1 的葡萄渣。试验共计4个处理,每个处理重复3次。将处理好的苜蓿与葡萄渣按制作比例混合均匀,按(1 000 ± 100) g·L−1的密度装填入1 L的塑料广口瓶中压实并密封,放置在避光室温处发酵60 d,取样进行相关指标的测定与分析。
1.3 测定项目及方法
1.3.1 青贮饲料营养品质的测定分析
将原料和青贮样在65 ℃烘箱中干燥48 h至恒重,粉碎过筛(0.425 mm)待用。处理好的原料和青贮样品参考Zhang和Zhao [14]描述的方法进行以下指标的测定:干物质(dry matter,DM) (烘干法),粗脂肪(ether extract,EE) 采用索氏抽提法,粗蛋白质(crude protein,CP)采用凯氏定氮法,中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)采用Van Soest洗涤纤维素分析法[15],粗灰分(crude ash,CA)采用灰化法。利用分光光度法测定可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrates,WSC)含量,并利用公式计算非纤维性碳水化合物(non-fiber carbohydrates,NFC)含量,NFC = 100 − CP − EE − NDF − Ash。参考蒋慧[16]的方法测定青贮原料乳酸菌、酵母菌和霉菌的数量。利用盐酸-正丁醇法测定葡萄渣单宁含量[17]。
1.3.2 青贮饲料发酵品质的测定分析
取50 g青贮原料,加150 mL蒸馏水,用榨汁机粉碎1 min,汁液经4层纱布过滤后用于后续指标测定。发酵品质中的pH利用酸度计进行测定;采用高效液相色谱法[18]测定乳酸(lactic acid,LA)、乙酸(acetic acid,AA)、丙酸(propionic acid,PA)和丁酸(butyric acids,BA);采用苯酚-次氯酸比色法[19]测定氨态氮(ammonia nitrogen,NH3-N);青贮发酵品质评价采用V-Score评分方法参考日本粗饲料评定手册[20],具体评分标准如表1所列。
表 1 V-Score评分标准Table 1. Calculation of the V-Score氨态氮
Ammonia nitrogen/%乙酸 + 丙酸
Acetic acid + propionic acid/%丁酸及以上挥发性脂肪酸
Butyric acid and above volatile fatty acid/%V-Score XN 计算式
Formula (YN)XA 计算式
Formula (YA)XB 计算式
Formula (YB)≤ 5 YN = 50 ≤ 0.2 YA = 10 0~0.5 YB = 40 − 80XB Y = YN + YA + YB 5~10 YN = 60 − 2XN 0.2~1.5 YA = (150 − 100XA)/13 > 0.5 0 10~20 YN = 80 − 4XN 1.5 < YA = 0 > 20 YN = 0 XN、 XA、 XB分别为氨态氮、乙酸 + 丙酸和丁酸及以上挥发性脂肪酸的含量; YN、 YA、 YB分别为氨态氮、乙酸 + 丙酸和丁酸及以上挥发性脂肪酸的得分; Y为总得分。
XN, XA, and XB are the content of ammonia nitrogen, acetate acid + propionate acid and butyric acid and above volatile fatty acid, respectively; YN, YA, and YB are the scores of ammonia nitrogen, acetate acid + propionate acid, and butyric acid and above volatile fatty acid, respectively; Y is the total score.1.3.3 青贮饲料体外产气特征相关指标的测定分析
瘤胃液取自3头装有瘤胃瘘管、体重年龄相似、第2胎次的泌乳初期荷斯坦母牛,将瘤胃液与人工瘤胃缓冲液按1 ꞉ 2比例混合均匀,参考王永力[21]的方法进行体外发酵试验。称取0.4 g青贮饲料样品装入尼龙袋并放于升温至39 ℃的发酵瓶中,然后加入30 mL的培养液,再向发酵瓶中通入CO2气体至饱和,封口后在39 ℃恒温培养箱中培养48 h,每个处理设3个重复,1个空白对照。测定发酵各时间点(2、4、8、12、24、36、48 h)的产气量(gas production,GP)。在瘤胃体外发酵48 h结束后,取出尼龙袋,并用蒸馏水冲洗干净,放置于105 ℃烘箱中干燥3 h,测定DM、CP、NDF和ADF残留量,后分别计算出体外干物质消化率(in vitro dry matter digestibility,IVDMD)、体外粗蛋白消化率(in vitro crude protein digestibility,IVCPD)、体外中性洗涤纤维消化率(in vitro neutral detergent fibre digestibility,IVNDFD)和体外酸性洗涤纤维消化率(in vitro acid detergent fibre digestibility,IVADFD)。剩余发酵液参考张艳玲和张力莉[22]方法测定微生物蛋白(microbial crude protein,MCP)。
产气动力学模型[23]如下:
$$ GPt = A \times \left\{ {1 - {{\exp }^{\left[ { - c \times \left ( {t - Lag} \right)} \right]}}} \right\} 。 $$ 式中:GPt为在t时刻的累积产气量(mL·g−1),A为理论最大产气量(mL),c为产气速率常数(mL·h−1),t为产气时间(h),Lag为产气延滞时间(h)。
平均产气速率(average gas production rate,AGPR)的计算[24]公式如下:
$$ AGPR = \dfrac{{A \times {{c}}}}{{{\text{2}} \times \left ( {\ln 2 + c \times Lag} \right)}} 。 $$ 1.4 数据分析
利用Excel 2016进行数据的初步处理,然后用SPSS 26对数据进行方差分析,通过Duncan法和T检验对测定数据进行多重比较,并利用正交多项式对比分析,对苜蓿青贮添加不同比例葡萄渣进行线性和二次曲线拟合。试验数据用平均值 ± 标准差表示,P < 0.05表示差异显著,P > 0.05表示差异不显著。图表的绘制由Origin 2021完成。
根据灰色系统理论,将DM、CP、NDF、ADF、pH、V-Score、IVDMD、IVCPD、MCP、48 h体外产气量(gas production at 48 h, GP48)、达到产气量1/2所需时间(half time)、APGR共12项指标作为一个灰色系统,使用灰色关联度分析法对青贮进行综合评价[25]。以12个指标的最理想值构成理想的参考数列:X0(k) = {X0(1), X0(2), X0(3), …, X0(n)};以各指标的测定值构成比较数列:Xi(k) = {Xi(1), Xi(2), Xi(3), …, Xi(n)}。其中k = 1,2,3,…,n,n为测定指标数(n = 12),i = 1,2,3,…,m,m为测定的不同青贮处理组为(m = 4)。将各指标测定值用X′i(k) = Xi(k)/X0(k)进行无量纲化处理转化为评价值,并计算与各指标之间的关联系数(ρ为分辨系数,取值介于0~1,本研究取0.5)。
关联系数[$\xi_i (k) $]:
$$ \xi_i (k) = \dfrac{{\min_i\min_ k\left| {\Delta_i (k)} \right| + \rho \max_i\max_k\left| {\Delta_i (k)} \right|}}{{\left| {\Delta_i (k)} \right| + \rho \max_i\max_k\left| {\Delta_i (k)} \right|}} 。 $$ 由于各指标对青贮品质的重要度不同,在评价不同处理的好坏时还应根据其重要程度赋予不同的权重系数,并以加权关联度对各青贮处理进行评价。根据加权关联度的大小,可评价各青贮处理的优劣。
等权关联度($ \gamma i $):
$$ \gamma i = \dfrac{1}{n}\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^n {\xi_ i (k)} \text{;} $$ 权重系数($\omega_ i $):
$$ \omega_ i = \dfrac{{\gamma_ i}}{{\displaystyle\sum {\gamma_ i} }} \text{;} $$ 加权关联度($\gamma_ i' $):
$$ \gamma_ i' = \displaystyle\sum\limits_{k = i}^n {\omega_ i (k) \times \xi_ i (k)} 。 $$ 2. 结果与分析
2.1 青贮原料的营养特性
葡萄渣和苜蓿的常规营养成分及微生物数量表明,与新鲜的苜蓿原料(pH 6.00)相比,葡萄渣有着较低的pH (3.68) (表2)。葡萄渣中的DM、WSC、NDF、ADF、EE和CA含量均显著高于苜蓿(P < 0.05),而CP和NFC含量要显著低于苜蓿(P < 0.05);葡萄渣表面附着的乳酸菌和酵母菌数量均高于苜蓿,但表面附着的霉菌数量低于苜蓿。
表 2 青贮原料的化学成分Table 2. Chemical composition of silage materials指标
Item苜蓿
Alfalfa葡萄渣
Grape pomace干物质 Dry matter (DM)/(g·kg−1) 334.07 ± 7.00b 947.52 ± 0.58a pH 6.00 ± 0.02a 3.68 ± 0.06b 可溶性碳水化合物 Water soluble carbohydrate (WSC)/(g·kg−1) 14.06 ± 1.70b 61.80 ± 1.90a 粗蛋白 Crude protein (CP)/(g·kg−1) 156.50 ± 8.50a 130.83 ± 1.53b 粗脂肪 Ether extract (EE)/(g·kg−1) 19.50 ± 0.85b 138.13 ± 2.00a 中性洗涤纤维 Neutral detergent fiber (NDF)/(g·kg−1) 334.13 ± 5.00b 360.52 ± 2.52a 酸性洗涤纤维 Acid detergent fiber (ADF)/(g·kg−1) 271.24 ± 2.52b 286.72 ± 4.51a 粗灰分 Crude ash (CA)/(g·kg−1) 70.20 ± 1.45b 90.50 ± 1.20a 非纤维性碳水化合物 Non-fiber carbohydrate (NFC)/(g·kg−1) 420.10 ± 12.9a 280.51 ± 2.20b 乳酸菌 Lactic acid bacteria (LAB)/(log10 cfu·g−1) 3.30 ± 0.31b 5.60 ± 0.37a 酵母菌 Yeast/(log10 cfu·g−1) 6.21 ± 0.67b 10.10 ± 0.22a 霉菌 Mould/(log10 cfu·g−1) 2.53 ± 0.21 < 1.00 单宁含量 Tannin content/(g·kg−1) − 43.5 ± 0.60 同行不同小写字母表示相同指标不同原料间差异显著(P < 0.05)。“−”表示含量极低未检测出。
Different lowercase letters in the same row indicate significant differences between different silage materials at the 0.05 level; “−” indicates very low levels (not detected).2.2 葡萄渣对苜蓿青贮营养品质的影响
与对照相比,添加葡萄渣对苜蓿青贮的DM和EE影响显著(P < 0.05) (表3);C1、C2和C3组的DM含量显著高于对照组(P < 0.05),较对照处理分别增加了18.88%、22.02%和20.83%,但3组处理间无显著差异(P > 0.05);C3组的CP含量显著高于对照组(P < 0.05),提高了7.73%;添加葡萄渣对苜蓿青贮的NDF、ADF、CA和NFC含量没有显著影响(P > 0.05)。此外,随着葡萄渣比例的增加,苜蓿混合青贮的DM和EE呈线性升高(P < 0.05),同时,也存在显著的二次曲线效应(P < 0.05)。
表 3 葡萄渣对苜蓿青贮营养品质的影响Table 3. Effect of grape pomace on the nutritional quality of alfalfa silage指标 Item 处理 Treatment P 对照
ControlC1 C2 C3 组间
Group线性
Linear二次
Quadratic干物质 Dry matter (DM)/(g·kg−1) 392.00 ± 10.52b 466.00 ± 8.89a 478.33 ± 3.06a 473.67 ± 6.66a < 0.01 < 0.01 < 0.01 粗蛋白 Crude protein (CP)/(g·kg−1) 151.00 ± 2.65b 161.33 ± 2.08ab 157.33 ± 9.71ab 162.67 ± 4.04a 0.12 0.06 0.46 中性洗涤纤维
Neutral detergent fiber (NDF)/(g·kg−1)354.67 ± 11.21 353.67 ± 7.37 351.67 ± 3.51 353.67 ± 8.33 0.97 0.82 0.76 酸性洗涤纤维
Acid detergent fiber (ADF)/(g·kg−1)285.00 ± 8.54 284.00 ± 7.55 282.33 ± 9.02 283.33 ± 8.08 0.98 0.76 0.84 粗灰分 Crude ash (CA)/(g·kg−1) 100.80 ± 2.31 94.33 ± 4.66 103.50 ± 8.26 100.33 ± 7.54 0.38 0.64 0.66 粗脂肪 Ether extract (EE)/(g·kg−1) 22.91 ± 0.67c 72.50 ± 3.90b 74.17 ± 2.61ab 78.10 ± 2.20a < 0.01 < 0.01 < 0.01 非纤维性碳水化合物
Non-fiber carbohydrate (NFC)/(g·kg−1)305.20 ± 13.12 318.17 ± 13.22 313.33 ± 17.80 305.23 ± 21.91 0.97 0.92 0.31 同行不同小写字母表示相同指标不同处理间差异显著(P < 0.05);C1:添加100 g·kg−1葡萄渣;C2:添加150 g·kg−1葡萄渣;C3:添加200 g·kg−1葡萄渣。下表同。
Different lowercase letters in the same row indicate significant difference between different treatment at the 0.05 level; C1: addition of 100 g·kg−1 grape pomace, C2: addition of 150 g·kg−1 grape pomace, C3: addition of 200 g·kg−1 grape pomace. This is applicable for the following tables as well.2.3 葡萄渣对苜蓿青贮发酵品质的影响
苜蓿单独青贮时pH为5.06 (表4),添加葡萄渣混合青贮处理的pH均降至4.52以下,其中C3组的pH最低,为4.16;对照组的NH3-N含量显著高于其他处理组(P < 0.05);C3组的LA含量最高,AA含量最低,均显著高于或低于其他处理(P < 0.05);C3组的PA含量显著低于对照组和C1组(P < 0.05),与C2组无显著差异(P > 0.05);4个处理组中仅对照组检测出了极少量的BA含量,其他3个处理均没有BA产生。在V-Score评分体系中对照组的得分为87.92分,其余3个处理组评分均大于等于90分。此外,随着葡萄渣比例的增加,苜蓿混合青贮的pH、AA、PA、和NH3-N呈线性下降(P < 0.05),LA和V-Score得分呈线性升高(P < 0.05),其中除V-Score得分以外都存在显著的二次曲线效应(P < 0.05)。
表 4 葡萄渣对苜蓿青贮发酵品质的影响Table 4. Effect of grape pomace on the fermentation quality of alfalfa silage指标
Item处理 Treatment P 对照
ControlC1 C2 C3 组间
Group线性
Linear二次
QuadraticpH 5.06 ± 0.05a 4.52 ± 0.04b 4.43 ± 0.07b 4.16 ± 0.05c < 0.01 < 0.01 < 0.01 乳酸 Lactic acid (LA)/(g·kg−1) 23.37 ± 0.95d 41.20 ± 1.95c 50.07 ± 1.31b 56.53 ± 0.91a < 0.01 < 0.01 < 0.01 乙酸 Acetic acid (AA)/(g·kg−1) 34.77 ± 1.67a 23.27 ± 1.77b 16.30 ± 0.92c 11.80 ± 0.90d < 0.01 < 0.01 < 0.01 丙酸 Propionic acid (PA)/(g·kg−1) 0.84 ± 0.08a 0.37 ± 0.05b 0.28 ± 0.03bc 0.22 ± 0.04c < 0.01 < 0.01 < 0.01 丁酸 Butyric acid (BA)/(g·kg−1) 0.05 ± 0.02 − − − < 0.01 < 0.01 < 0.01 氨态氮 NH3-N/(g·kg−1) 58.40 ± 1.81a 32.70 ± 0.35b 24.27 ± 0.96c 18.30 ± 1.25d < 0.01 < 0.01 < 0.01 V-Score 87.92 ± 0.52c 90.00 ± 0.00b 90.00 ± 0.00b 92.29 ± 0.67a < 0.01 < 0.01 0.68 2.4 葡萄渣对苜蓿青贮体外消化pH和氨态氮及微生物蛋白的影响
随着葡萄渣添加量增加,pH呈逐渐降低的趋势(表5)。C3组pH最低,但与其他各处理间无显著差异(P > 0.05);体外发酵48 h,C2组的MCP含量显著高于其他3个处理(P < 0.05),NH3-N含量显著高于对照和C1组(P < 0.05),与C3组差异不显著(P > 0.05);C3组的MCP含量显著低于其他3个处理(P < 0.05)。此外,随着葡萄渣比例的增加,苜蓿混合青贮体外消化NH3-N和MCP呈线性升高(P < 0.05),其中,MCP存在显著的二次曲线效应(P < 0.05)。
表 5 葡萄渣对苜蓿青贮体外消化pH、氨态氮及微生物蛋白的影响Table 5. Effect of grape pomace on the in vitro digestion of pH, ammonia nitrogen, and microbial protein of alfalfa silage指标
Item处理 Treatment P 对照
ControlC1 C2 C3 组间
Group线性
Linear二次
QuadraticpH 6.58 ± 0.07 6.56 ± 0.05 6.54 ± 0.04 6.52 ± 0.04 0.47 0.14 0.86 氨态氮
NH3-N/(mg·mL−1)0.13 ± 0.00b 0.13 ± 0.00b 0.14 ± 0.00a 0.14 ± 0.00ab 0.03 0.02 0.54 微生物蛋白
Microbial crude protein (MCP)/(mg·mL−1)0.53 ± 0.00b 0.53 ± 0.00b 0.54 ± 0.00a 0.49 ± 0.00c < 0.01 < 0.01 < 0.01 2.5 葡萄渣对苜蓿青贮体外产气量和体外消化率的影响
4个处理组的累计产气量随着体外发酵时间的增加而增加(图1),在发酵初期增长速度最快,后期逐渐缓慢;48 h的GP排序为C2 > C3 > C1 > 对照组。
C2组的IVDMD显著高于其他3个处理(P < 0.05) (表6);IVCPD显著高于对照组和C1组;C3组的IVNDFD显著高于对照组,与C1组和C2组无显著差异(P > 0.05);4个处理的IVADFD无显著差异。产气参数方面,向苜蓿青贮中添加葡萄渣均可显著增加A、c和AGPR (P < 0.05),同时显著降低Half time (P < 0.05), C2组的A、c和AGPR显著高于其他3个处理,Half time显著低于其他3个处理(P < 0.05)。此外,随着葡萄渣比例的增加,苜蓿混合青贮IVDMD、IVCPD、GP48、A、c和AGPR都呈线性升高(P < 0.05),并且IVDMD、GP48、A、c和AGPR存在显著的二次曲线效应(P < 0.05)。
表 6 葡萄渣对苜蓿青贮48 h体外消化率和产气参数的影响Table 6. Effect of grape pomace on 48 h in vitro digestibility and gas production parameters of alfalfa silage指标
Item处理 Treatment P 对照
ControlC1 C2 C3 组间
Group线性
Linear二次
Quadratic体外干物质消化率
In vitro dry matter digestibility (IVDMD)/%62.70 ± 0.40b 62.60 ± 0.26b 65.60 ± 0.70a 63.33 ± 0.71b < 0.01 < 0.01 < 0.01 体外粗蛋白消化率
In vitro crude protein digestibility (IVCPD)/%0.50 ± 0.02c 0.54 ± 0.02b 0.57 ± 0.01a 0.55 ± 0.01ab < 0.01 < 0.01 0.02 体外中性洗涤纤维消化率
In vitro neutral detergent fibre digestibility (IVNDFD)/%0.50 ± 0.01b 0.51 ± 0.00ab 0.51 ± 0.00ab 0.52 ± 0.01a 0.08 0.03 0.26 体外酸性洗涤纤维消化率
In vitro acid detergent fibre digestibility (IVADFD)/%0.29 ± 0.02 0.30 ± 0.01 0.30 ± 0.02 0.29 ± 0.02 0.93 0.93 0.56 48 h体外产气量
Gas production at 48 h (GP48)/(mL·g−1)85.13 ± 0.31c 86.80 ± 0.56b 88.77 ± 0.31a 87.40 ± 1.05b < 0.01 < 0.01 < 0.01 理论最大产气量
Asymptotic gas production (A)/mL85.14 ± 0.31c 86.79 ± 0.59b 88.79 ± 0.31a 87.39 ± 1.05b < 0.01 < 0.01 < 0.01 产气速率
Rate of gas production (c)/(mL·h−1)0.45 ± 0.00c 0.46 ± 0.00b 0.47 ± 0.00a 0.46 ± 0.01b < 0.01 < 0.01 < 0.01 产气延滞时间
The time delay to the start of gas production (Lag)/h0.01 ± 0.00 0.01 ± 0.00 0.01 ± 0.00 0.01 ± 0.00 达到产气量1/2所需时间
Half time/h3.96 ± 0.07a 3.65 ± 0.12b 3.33 ± 0.09c 3.64 ± 0.08b < 0.01 < 0.01 < 0.01 平均产气速率
Average gas production rate (AGPR)/(mL·h−1)27.44 ± 0.19c 28.53 ± 0.41b 29.86 ± 0.20a 28.94 ± 0.72b < 0.01 < 0.01 < 0.01 2.6 不同处理下青贮评价指标的加权关联度和排序结果
对4个处理12个指标的加权关联度值进行排序得出,将葡萄渣与苜蓿进行混合青贮后,青贮饲料综合品质由高到低依次是C2 > C3 > C1 > 对照组(表7)。
表 7 不同处理下青贮评价指标的加权关联度和排序结果Table 7. Weighted correlations and ranking results of silage evaluation indicators under different treatments处理
Treatment加权关联度
Weighted incidence degree综合排序
Comprehensive rankingC2 0.9374 Ⅰ C3 0.8489 Ⅱ C1 0.7904 Ⅲ 对照 Control 0.6519 Ⅳ 3. 讨论
3.1 葡萄渣对苜蓿青贮营养品质的影响
CP含量是评估青贮饲料营养品质的重要指标之一,CP含量越高表明青贮的饲用价值越高[26],在本研究中,添加200 g·kg−1 葡萄渣的苜蓿青贮CP含量显著高于苜蓿单独青贮,这可能是葡萄渣中的缩合单宁抑制了蛋白水解酶的活性,从而降低了苜蓿青贮蛋白水解的程度,提高了CP含量[12]。
研究表明,NDF和ADF的含量分别与动物的采食量和消化率负相关,是判断饲料中纤维好坏的重要标准[27]。在本研究中,添加葡萄渣苜蓿混合青贮的NDF和ADF含量均低于对照组,这可能与葡萄渣中含有脲酶有关,在青贮发酵前期,葡萄渣中的脲酶能在青贮中产生氨,氨又与水结合成氨水,氨水电离出的氢氧根离子可以断裂木质素和纤维素之间的酯键,溶解半纤维素和部分木质素,从而降低NDF和ADF的含量[28]。
3.2 葡萄渣对苜蓿青贮发酵品质的影响
青贮饲料中pH、NH3-N和有机酸的含量是评价青贮发酵品质的关键指标[29]。在青贮饲料中,pH越低,表明青贮发酵品质越好,当青贮饲料pH低于4.2时视为发酵良好[30]。在本研究中,向苜蓿青贮中添加不同量的葡萄渣,能使混合青贮pH显著下降,并能提高混合青贮的LA含量,这与柯文灿等[31]研究结果一致。葡萄渣中的单宁有着抑菌活性,在低pH环境下其抑菌性更强,而LAB可以耐受更低的pH,从而成为青贮发酵中的主导菌群[32]。本研究中,添加葡萄渣处理组青贮LA含量显著高于苜蓿单独青贮处理组,其中C3组的pH最低,LA含量最高,与上述研究结果一致。
V-Score青贮发酵品质评价系统是利用青贮中有机酸和NH3-N的含量来反映青贮的发酵品质,一般品质较好的青贮饲料中BA和NH3-N含量应分别低于0.1%和10% [33],在青贮饲料中NH3-N含量越高表明蛋白质的降解越严重,从而直接影响到动物的采食量和饲草利用率[34],在本研究中各处理的BA和NH3-N含量均分别低于0.1%和0.14 mg·mL−1,V-Score评分也均高于80分,都达到良好等级以上,且添加200 g·kg−1葡萄渣的苜蓿混合青贮评分最高,为92.29分。其中添加葡萄渣处理组的NH3-N含量显著低于对照组,这可能与葡萄渣原料自身附着较多乳酸菌有关,乳酸菌可促进LA的发酵进程,快速降低pH,抑制蛋白质水解,降低NH3-N含量。
3.3 葡萄渣对苜蓿青贮体外消化特征的影响
瘤胃内pH是反映瘤胃发酵水平的一个综合性指标,瘤胃pH一般介于5.5~7.5 [35],当pH不在此范围内,无论过高或过低都会影响瘤胃内微生物的活性,从而影响到瘤胃的发酵性能。本研究各处理组的瘤胃pH均介于6.52~6.58,适合瘤胃微生物的生长和瘤胃发酵,瘤胃pH与前人研究适合瘤胃消化纤维和干物质的最适pH (6.5)相同[36]。本研究结果表明葡萄渣苜蓿混合青贮在瘤胃内发酵效果良好,对瘤胃内发酵环境无不利影响,适合瘤胃发酵。
瘤胃NH3-N含量可以反映青贮中蛋白质在瘤胃中的消化情况[37],影响着MCP的合成,MCP的合成需要瘤胃NH3-N维持在适宜的含量范围内[38],本研究的NH3-N含量介于0.13~0.14 mg·mL−1,与韩正康和陈杰[39]研究的瘤胃内NH3-N含量应该在0.1~0.5 mg·mL−1范围的结果一致。在本研究中随着葡萄渣的加入,NH3-N含量也有着增加的趋势,这可能与葡萄渣本身蛋白含量较高有关。
反刍动物瘤胃内的厌氧微生物可以将蛋白质水解为游离氨基酸、小肽和氨,并以挥发性脂肪酸和二氧化碳为碳架生成MCP,因此MCP含量的多少,也可反映瘤胃发酵的好坏[40]。葡萄渣富含缩合单宁,有研究表明在奶牛日粮中添加缩合单宁会降低MCP的合成效率[41],在本研究中,C2组的MCP含量最高,并且显著高于对照组,表明合适的葡萄渣添加量可以提高苜蓿青贮发酵液中MCP的含量,这与张艳玲和张力莉[22]等结果一致。
GP与瘤胃降解率有着密切的关系,GP的多少能够直观反映饲料在瘤胃中的降解程度[42]。而GP与产气速率成正比,产气速率越快,累计产气量越高,从而饲料的消化率就越高,表明饲料中可利用的营养成分也就越多。张力莉等[43]研究表明,随着葡萄残渣添加量的增加,GP也不断上升,与本研究结果一致。在本研究中,添加葡萄渣苜蓿青贮组的GP48、A、c和AGPR均显著高于对照组。IVDMD的高低,可以反映饲料在反刍动物体内消化的难易程度[44]。IVDMD越高,表明饲料品质越好。在本研究中C2组显著提高了苜蓿青贮IVDMD和IVCPD,这可能是添加葡萄渣后,苜蓿混合青贮营养品质提升,促使瘤胃微生物活动增加,从而提高了降解率,也可能是葡萄渣中缩合单宁抑制了有害微生物的生长,从而抑制了蛋白质的水解,减少了植物细胞内容物的损失,保留了营养物质,从而提高了IVDMD和IVCPD。结果表明,在苜蓿青贮中添加一定含量的葡萄渣可以提高苜蓿青贮的消化效率。
4. 结论
向苜蓿青贮中添加葡萄渣可显著降低青贮饲料的pH、NH3-N含量,提高了V-Score评分、CP和LA含量,提升DM和CP体外消化率。同时增加体外产气量,改善体外消化率。其中以添加150 g·kg−1葡萄渣与苜蓿进行混合青贮效果最佳。
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表 1 V-Score评分标准
Table 1 Calculation of the V-Score
氨态氮
Ammonia nitrogen/%乙酸 + 丙酸
Acetic acid + propionic acid/%丁酸及以上挥发性脂肪酸
Butyric acid and above volatile fatty acid/%V-Score XN 计算式
Formula (YN)XA 计算式
Formula (YA)XB 计算式
Formula (YB)≤ 5 YN = 50 ≤ 0.2 YA = 10 0~0.5 YB = 40 − 80XB Y = YN + YA + YB 5~10 YN = 60 − 2XN 0.2~1.5 YA = (150 − 100XA)/13 > 0.5 0 10~20 YN = 80 − 4XN 1.5 < YA = 0 > 20 YN = 0 XN、 XA、 XB分别为氨态氮、乙酸 + 丙酸和丁酸及以上挥发性脂肪酸的含量; YN、 YA、 YB分别为氨态氮、乙酸 + 丙酸和丁酸及以上挥发性脂肪酸的得分; Y为总得分。
XN, XA, and XB are the content of ammonia nitrogen, acetate acid + propionate acid and butyric acid and above volatile fatty acid, respectively; YN, YA, and YB are the scores of ammonia nitrogen, acetate acid + propionate acid, and butyric acid and above volatile fatty acid, respectively; Y is the total score.表 2 青贮原料的化学成分
Table 2 Chemical composition of silage materials
指标
Item苜蓿
Alfalfa葡萄渣
Grape pomace干物质 Dry matter (DM)/(g·kg−1) 334.07 ± 7.00b 947.52 ± 0.58a pH 6.00 ± 0.02a 3.68 ± 0.06b 可溶性碳水化合物 Water soluble carbohydrate (WSC)/(g·kg−1) 14.06 ± 1.70b 61.80 ± 1.90a 粗蛋白 Crude protein (CP)/(g·kg−1) 156.50 ± 8.50a 130.83 ± 1.53b 粗脂肪 Ether extract (EE)/(g·kg−1) 19.50 ± 0.85b 138.13 ± 2.00a 中性洗涤纤维 Neutral detergent fiber (NDF)/(g·kg−1) 334.13 ± 5.00b 360.52 ± 2.52a 酸性洗涤纤维 Acid detergent fiber (ADF)/(g·kg−1) 271.24 ± 2.52b 286.72 ± 4.51a 粗灰分 Crude ash (CA)/(g·kg−1) 70.20 ± 1.45b 90.50 ± 1.20a 非纤维性碳水化合物 Non-fiber carbohydrate (NFC)/(g·kg−1) 420.10 ± 12.9a 280.51 ± 2.20b 乳酸菌 Lactic acid bacteria (LAB)/(log10 cfu·g−1) 3.30 ± 0.31b 5.60 ± 0.37a 酵母菌 Yeast/(log10 cfu·g−1) 6.21 ± 0.67b 10.10 ± 0.22a 霉菌 Mould/(log10 cfu·g−1) 2.53 ± 0.21 < 1.00 单宁含量 Tannin content/(g·kg−1) − 43.5 ± 0.60 同行不同小写字母表示相同指标不同原料间差异显著(P < 0.05)。“−”表示含量极低未检测出。
Different lowercase letters in the same row indicate significant differences between different silage materials at the 0.05 level; “−” indicates very low levels (not detected).表 3 葡萄渣对苜蓿青贮营养品质的影响
Table 3 Effect of grape pomace on the nutritional quality of alfalfa silage
指标 Item 处理 Treatment P 对照
ControlC1 C2 C3 组间
Group线性
Linear二次
Quadratic干物质 Dry matter (DM)/(g·kg−1) 392.00 ± 10.52b 466.00 ± 8.89a 478.33 ± 3.06a 473.67 ± 6.66a < 0.01 < 0.01 < 0.01 粗蛋白 Crude protein (CP)/(g·kg−1) 151.00 ± 2.65b 161.33 ± 2.08ab 157.33 ± 9.71ab 162.67 ± 4.04a 0.12 0.06 0.46 中性洗涤纤维
Neutral detergent fiber (NDF)/(g·kg−1)354.67 ± 11.21 353.67 ± 7.37 351.67 ± 3.51 353.67 ± 8.33 0.97 0.82 0.76 酸性洗涤纤维
Acid detergent fiber (ADF)/(g·kg−1)285.00 ± 8.54 284.00 ± 7.55 282.33 ± 9.02 283.33 ± 8.08 0.98 0.76 0.84 粗灰分 Crude ash (CA)/(g·kg−1) 100.80 ± 2.31 94.33 ± 4.66 103.50 ± 8.26 100.33 ± 7.54 0.38 0.64 0.66 粗脂肪 Ether extract (EE)/(g·kg−1) 22.91 ± 0.67c 72.50 ± 3.90b 74.17 ± 2.61ab 78.10 ± 2.20a < 0.01 < 0.01 < 0.01 非纤维性碳水化合物
Non-fiber carbohydrate (NFC)/(g·kg−1)305.20 ± 13.12 318.17 ± 13.22 313.33 ± 17.80 305.23 ± 21.91 0.97 0.92 0.31 同行不同小写字母表示相同指标不同处理间差异显著(P < 0.05);C1:添加100 g·kg−1葡萄渣;C2:添加150 g·kg−1葡萄渣;C3:添加200 g·kg−1葡萄渣。下表同。
Different lowercase letters in the same row indicate significant difference between different treatment at the 0.05 level; C1: addition of 100 g·kg−1 grape pomace, C2: addition of 150 g·kg−1 grape pomace, C3: addition of 200 g·kg−1 grape pomace. This is applicable for the following tables as well.表 4 葡萄渣对苜蓿青贮发酵品质的影响
Table 4 Effect of grape pomace on the fermentation quality of alfalfa silage
指标
Item处理 Treatment P 对照
ControlC1 C2 C3 组间
Group线性
Linear二次
QuadraticpH 5.06 ± 0.05a 4.52 ± 0.04b 4.43 ± 0.07b 4.16 ± 0.05c < 0.01 < 0.01 < 0.01 乳酸 Lactic acid (LA)/(g·kg−1) 23.37 ± 0.95d 41.20 ± 1.95c 50.07 ± 1.31b 56.53 ± 0.91a < 0.01 < 0.01 < 0.01 乙酸 Acetic acid (AA)/(g·kg−1) 34.77 ± 1.67a 23.27 ± 1.77b 16.30 ± 0.92c 11.80 ± 0.90d < 0.01 < 0.01 < 0.01 丙酸 Propionic acid (PA)/(g·kg−1) 0.84 ± 0.08a 0.37 ± 0.05b 0.28 ± 0.03bc 0.22 ± 0.04c < 0.01 < 0.01 < 0.01 丁酸 Butyric acid (BA)/(g·kg−1) 0.05 ± 0.02 − − − < 0.01 < 0.01 < 0.01 氨态氮 NH3-N/(g·kg−1) 58.40 ± 1.81a 32.70 ± 0.35b 24.27 ± 0.96c 18.30 ± 1.25d < 0.01 < 0.01 < 0.01 V-Score 87.92 ± 0.52c 90.00 ± 0.00b 90.00 ± 0.00b 92.29 ± 0.67a < 0.01 < 0.01 0.68 表 5 葡萄渣对苜蓿青贮体外消化pH、氨态氮及微生物蛋白的影响
Table 5 Effect of grape pomace on the in vitro digestion of pH, ammonia nitrogen, and microbial protein of alfalfa silage
指标
Item处理 Treatment P 对照
ControlC1 C2 C3 组间
Group线性
Linear二次
QuadraticpH 6.58 ± 0.07 6.56 ± 0.05 6.54 ± 0.04 6.52 ± 0.04 0.47 0.14 0.86 氨态氮
NH3-N/(mg·mL−1)0.13 ± 0.00b 0.13 ± 0.00b 0.14 ± 0.00a 0.14 ± 0.00ab 0.03 0.02 0.54 微生物蛋白
Microbial crude protein (MCP)/(mg·mL−1)0.53 ± 0.00b 0.53 ± 0.00b 0.54 ± 0.00a 0.49 ± 0.00c < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 6 葡萄渣对苜蓿青贮48 h体外消化率和产气参数的影响
Table 6 Effect of grape pomace on 48 h in vitro digestibility and gas production parameters of alfalfa silage
指标
Item处理 Treatment P 对照
ControlC1 C2 C3 组间
Group线性
Linear二次
Quadratic体外干物质消化率
In vitro dry matter digestibility (IVDMD)/%62.70 ± 0.40b 62.60 ± 0.26b 65.60 ± 0.70a 63.33 ± 0.71b < 0.01 < 0.01 < 0.01 体外粗蛋白消化率
In vitro crude protein digestibility (IVCPD)/%0.50 ± 0.02c 0.54 ± 0.02b 0.57 ± 0.01a 0.55 ± 0.01ab < 0.01 < 0.01 0.02 体外中性洗涤纤维消化率
In vitro neutral detergent fibre digestibility (IVNDFD)/%0.50 ± 0.01b 0.51 ± 0.00ab 0.51 ± 0.00ab 0.52 ± 0.01a 0.08 0.03 0.26 体外酸性洗涤纤维消化率
In vitro acid detergent fibre digestibility (IVADFD)/%0.29 ± 0.02 0.30 ± 0.01 0.30 ± 0.02 0.29 ± 0.02 0.93 0.93 0.56 48 h体外产气量
Gas production at 48 h (GP48)/(mL·g−1)85.13 ± 0.31c 86.80 ± 0.56b 88.77 ± 0.31a 87.40 ± 1.05b < 0.01 < 0.01 < 0.01 理论最大产气量
Asymptotic gas production (A)/mL85.14 ± 0.31c 86.79 ± 0.59b 88.79 ± 0.31a 87.39 ± 1.05b < 0.01 < 0.01 < 0.01 产气速率
Rate of gas production (c)/(mL·h−1)0.45 ± 0.00c 0.46 ± 0.00b 0.47 ± 0.00a 0.46 ± 0.01b < 0.01 < 0.01 < 0.01 产气延滞时间
The time delay to the start of gas production (Lag)/h0.01 ± 0.00 0.01 ± 0.00 0.01 ± 0.00 0.01 ± 0.00 达到产气量1/2所需时间
Half time/h3.96 ± 0.07a 3.65 ± 0.12b 3.33 ± 0.09c 3.64 ± 0.08b < 0.01 < 0.01 < 0.01 平均产气速率
Average gas production rate (AGPR)/(mL·h−1)27.44 ± 0.19c 28.53 ± 0.41b 29.86 ± 0.20a 28.94 ± 0.72b < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 7 不同处理下青贮评价指标的加权关联度和排序结果
Table 7 Weighted correlations and ranking results of silage evaluation indicators under different treatments
处理
Treatment加权关联度
Weighted incidence degree综合排序
Comprehensive rankingC2 0.9374 Ⅰ C3 0.8489 Ⅱ C1 0.7904 Ⅲ 对照 Control 0.6519 Ⅳ -
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