川西北地区位于四川省西北部，青藏高原东南缘，是全国五大牧区之一，草地畜牧业是当地重要的经济支柱产业^[1-2]。当地海拔高，积温不足，导致饲草生长季短，产量低，供需矛盾突出，严重限制畜牧业持续、健康发展。此外，受湿冷气候的限制，收获季节干草难以调制，青贮技术在延长饲料保存时间的同时最大限度地保留饲料的营养成分，是川西北地区饲料保存的有效方法之一^[3-4]。

乳酸菌在青贮饲料制作过程中具有重要作用，能够将青贮饲料中的碳水化合物代谢为乳酸和乙酸等有机酸，降低pH，抑制有害微生物的活性，减少蛋白质和干物质损失，从而改善青贮发酵品质，延长青贮饲料的保存时间^[5-6]。但乳酸菌具有专一性和特异性，在不同的环境温度下生长繁殖情况有所差异，乳酸菌的最适生长温度通常在25～37 ℃ ^[7-9]。低温胁迫时，乳酸菌生长缓慢，且过低的温度会造成乳酸菌细胞机械损伤，破坏细胞膜原有的结构，影响细胞功能的正常发挥。研究发现，在低温处理下，青贮饲料pH显著升高，乳酸含量显著降低，在15～25 ℃温度下青贮饲料产生的乙酸水平高于5 ℃或10 ℃处理的青贮饲料，5 ℃下青贮饲料的乳酸和乙酸含量均显著(P < 0.01)低于20 ℃处理下的青贮饲料，达到青贮稳定的时间增加，致使青贮饲料干物质、粗蛋白等营养物质大量损失^[10-11]。目前，常见商业青贮乳酸菌由于低温下生长受到限制，不适于作为低温地区的青贮发酵乳酸菌^[12-14]。川西北地区气候严寒，在7月后气温迅速降低到15 ℃以下，乳酸菌活性也随之迅速降低。因此，筛选耐低温的青贮乳酸菌对改善当地青贮品质至关重要^[15]。极端环境会对菌群的耐胁迫能力产生影响，在湿冷气候区域更容易筛选出在低温环境下生长良好、产酸速率快的乳酸菌，所以在川西北地区极端低温环境下筛选耐低温乳酸菌具有可行性^[16]。

燕麦(Avena sativa)是一种一年生禾本科粮饲兼用作物，由于其喜凉、营养价值高等特性在川西北地区被广泛种植^[17]。本研究从川西北地区的燕麦、玉米(Zea mays)青贮材料中筛选产酸快且生长活性好的耐低温乳酸菌，回接到燕麦青贮料中验证其发酵效果，以期发掘和利用川西北地区本土乳酸菌，旨在为当地青贮提供可利用的乳酸菌添加剂，改善当地青贮饲料品质。

1.   材料与方法

1.1   样品采集

本研究对四川省阿坝藏族羌族自治州泸定县泸桥镇、松潘县安宏乡、红原县瓦切镇、若尔盖县唐克乡、道孚县八美镇共6个地点的牧草以及原料进行采样，样点的基本环境信息和采样信息如表1所列，供试玉米品种为‘凉单10号’，燕麦品种为‘青引3号’。青贮饲料裹包开袋后，取上、中、下三部分的样品，充分混匀后置于无菌袋中，取10株玉米粉碎后混合，得到玉米鲜样。所取材料用冰袋保鲜，当天运回实验室，用于后续乳酸菌的分离。

表  1  样品类型和取样地点

Table  1.  Collection sites and types of samples

采样地点 Sampling site	样品类型 Sample type	海拔 Altitude/m	经度 Longitude (E)	纬度 Latitude (N)	年均温度 Annual temperature/℃	取样时间 Sampling time/ (YYYY-MM)
泸定县泸桥镇 Luqiao Town, Luding County	青贮燕麦 Silage oat	1 406	101°46′～102°25′	29°54′～30°10′	12～22	2019-07
松潘县安宏乡 Anhong Township, Songpan County	青贮玉米 Silage corn	2 850	102°38′～104°15	32°06′～33°09′	0～14	2019-03
红原县瓦切镇 Waqie Town, Hongyuan County	青贮燕麦 Silage oat	3 458	101°51′～103°22′	31°51′～33°33′′	−4～11	2019-05
若尔盖县唐克乡 Tangke Township, Zoige County	青贮玉米 Silage corn	3 431	102°08′～103°39′	32°56′～34°19′	−3～10	2019-06
道孚县八美镇 Bamei Town, Daofu County	玉米鲜样 Fresh corn	3 500	100°32′～101°44′	32°21′～30°32′	2～18	2019-10

下载: 导出CSV 

| 显示表格

1.2   试验方法

1.2.1   乳酸菌的分离与纯化

称取所有采集样品各20 g置于无菌锥形瓶中，加入180 mL灭菌的生理盐水，在4 ℃摇床上充分震荡1.5 h，取液体进行10倍梯度稀释，选择适合浓度梯度(1×10⁻¹、1×10⁻³、1×10⁻⁵)在MRS (Man Rogosa Sharpe，北京陆桥技术有限责任公司)培养基上分别进行涂板，将培养基置于15 ℃恒温无氧密封条件下培养5 d后^[17]，观察乳酸菌生长情况，依据菌落形态挑选出不同的乳酸菌菌落并连续分离和纯化两次，然后对菌株进行革兰氏染色、镜检观察、过氧化氢酶试验，初步确定革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的菌株为乳酸菌，最后将已鉴定的乳酸菌加入含灭菌甘油的液体MRS培养基中，并于−80 ℃保存^[18]。

1.2.2   耐低温乳酸菌筛选

将低温保存的乳酸菌快速解冻后接种至MRS液体培养基中活化培养(37 ℃，48 h)，进行两次传代后，按照3%的液体比例(V/V)将乳酸菌接种至MRS液体培养基中15 ℃培养72 h ^[19]，并分别在4、6、12、24、36、48、72 h用分光光度计在600 nm处测定其OD值(吸光度)和pH，分析乳酸菌在低温条件下的产酸能力及其对低温的适应能力，挑选出生长产酸性能最佳的耐低温菌。OD < 0.05时记为不生长，0.05 < OD < 0.1时记为微弱生长，0.1 < OD < 0.5时记为生长，OD > 0.5时记为生长良好^[20]。

15 ℃条件下对生长、产酸性能最佳的菌株进行葡萄糖产气试验，并接种于10 mL的MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养，分别于4、6、12、24、36和48 h在600 nm处测定吸光值和pH，同时在4、10和15 ℃中培养5 d，测定其不同低温条件下的生长性能和产酸速率，以筛选出生长速率最快、产酸效率最高和低温耐受性能最佳的乳酸菌，并将其保存。

1.2.3   耐低温乳酸菌的鉴定

将最优乳酸菌在37 ℃厌氧条件下培养48 h后，利用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA，并进行16S rRNA扩增，引物序列: 27 F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ )和1492 R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。然后，将PCR扩增产物送至北京擎科生物技术有限公司进行基因序列测定。将测序所得到的序列在GenBank数据库进行BLAST，比较序列相似性，并使用MEGA 7.0构建系统发育树。

1.2.4   自选菌株的生理生化特性测定

对耐低温乳酸菌、模式菌株(LPA，Lactobacillus paracasei ATCC 334，购自中国微生物菌种保藏中心)和商业植物乳杆菌(LPC，Lactobacillus plantarum，四川高福记生物技术有限公司)进行葡萄糖产气试验，然后将菌株接种至NaCl浓度为3.0%和6.5%的MRS液体培养基中，37 ℃下培养2 d后，测定其耐盐性。再将菌株分别置于pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0的MRS液体培养基中，37 ℃下培养3 d后，测定乳酸菌的耐酸性^[21]。通过糖源发酵测定3株乳酸菌对21种不同糖的利用情况，及4、10、15、20、30和40 ℃下的生长性能。

1.2.5   青贮调制

2022年8月底，在若尔盖县白河牧场(102°08′～103°39′ E，32°56′～34°19′ N)收割抽穗期的全株燕麦，用揉丝机切碎至1～2 cm，待含水量65%～70%，将筛选菌株YZ3添加于当地的燕麦草材料中进行窖贮，乳酸菌添加量为1×10⁶ cfu·g⁻¹，燕麦材料中加入等体积无菌去离子水进行窖贮，作为对照组，两组青贮温度为4～15 ℃，青贮窖为千吨窖，青贮90 d后开窖。

1.2.6   营养成分测定

开窖取样后测定燕麦青贮干物质(dry matter，DM)、粗蛋白(crude protein，CP)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrates，WSC)。CP含量采用GB/T 6432－1994测定，NDF含量采用NY/T 1459－2007方法测定，ADF含量采用GB/T 20806－2006方法测定，可溶性碳水化合物含量采用T/HXCY 023－2021测定。

1.2.7   发酵指标测定

青贮取样后，取20 g青贮材料放入灭菌锥形瓶中，加入180 mL蒸馏水，在4 ℃条件下浸泡24 h后，使用PHS-3C型pH计测定pH。氨态氮(NH₃-N/TN)含量依据Broderick等^[22]所用的方法测定，使用岛津高效液相色谱仪测定乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)、丁酸(butyric acid，BA)的含量，所用色谱柱为Shodex Rspak KC-811 S-DVB gel column，检测器为SPD-M10AVP，使用的流动相为3 mmol·L⁻¹高氯酸溶液，设置的流速为1 mL·min⁻¹，柱温50 ℃，检测的波长为210 nm，进样量5 μL。

1.3   数据统计与分析

采用Excel对数据进行初步处理，使用SPSS 23.0进行单因素方差分析，Duncan法进行均值的多重比较，并进行指标间的相关性和回归性分析，对不同菌株测定指标以及不同处理发酵品质数据进行显著性分析(P < 0.05，显著；P < 0.01，极显著)。

2.   结果与分析

2.1   乳酸菌的分离纯化及耐低温菌株筛选

对川西北高原5个地点的青贮样品和原料进行分离纯化、革兰氏染色、镜检和过氧化氢酶试验，获得103株乳酸菌，将其在15 ℃条件下培养，得到生长速率和产酸速率获得性状优良(48 h OD_{600 nm} > 0.5)的7株乳酸菌WQ2、WQ16、WQ19、WQ20、YZ1、YZ2和YZ3，7株乳酸菌均为杆状(图1)。

图  1  7种乳酸菌的胞形态和菌落分离形态

Figure  1.  The cell morphology and colony separation morphology of seven kinds of lactic acid bacteria

下载: 全尺寸图片 幻灯片

在37 ℃条件下，YZ3在前12 h的生长性能明显优于其他菌株，在12 h时达到峰值，且产酸能力强于其他5种菌株，在37 ℃条件下的综合性能最佳(图2)。15 ℃条件下，除WQ16、YZ1的生长微弱，其他菌株均能正常生长，产酸能力与生长性能趋于一致；在10 ℃条件下，WQ19、YZ3菌株的生长性能最强，显著高于其他菌株(P < 0.05)，且YZ3的产酸能力显著强于WQ19 (P < 0.05)；在4 ℃条件下，WQ19生长能力最强，YZ3次之，但YZ3产酸能力与WQ19相比显著增强(P < 0.05) (图3)。综上，在3个低温条件下，YZ3在6株菌株中生长产酸综合性能最佳。

图  2  37 ℃下乳酸菌的生长速率(a)和产酸速率(b)

Figure  2.  The growth rate (a) and acid production rate (b) of lactic acid bacteria under 37 ℃

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  3  不同温度下乳酸菌的生长及产酸能力

不同小写字母表示不同处理间差异显著(P < 0.05)。

Figure  3.  The growth and acid production capacity at different temperatures

Different lowercase letters indicate significant differences between the different treatments at the 0.05 level.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   耐低温乳酸菌生理特性分析

耐低温乳酸菌生理特性分析表明(表2)，YZ3、LPA和LPC均可利用菊粉、水杨苷、山梨醇、蔗糖、D-果糖、D-甘露醇、马尿酸、麦芽糖、棉子糖、D-甘露糖、水杨素、乳糖、D-葡萄糖、半乳糖；均不可利用木糖、鼠李糖。YZ3不可利用阿拉伯糖、半固体琼脂、蜜二糖、苦杏仁苷、D-海藻糖。LPC的糖源利用范围最广，YZ3的糖源利用范围最窄，但与LPA相比，YZ3可发酵纤维二糖。

表  2  乳酸菌糖发酵特性

Table  2.  Characteristics of sugar fermentation of lactic acid bacteria

项目 Item	YZ3	LPA	LPC
菊粉 Inulin	W	+	+
水杨苷 Salicin	+	+	+
纤维二糖 Cellobiose	+	−	+
山梨醇 Sorbitol	+	+	+
蔗糖 Saccharose	+	+	+
阿拉伯糖 Arabinose	−	+	+
D-果糖 D-Fructose	+	+	+
木糖 Xylose	−	−	−
D-甘露醇 D-Mannitol	+	+	+
马尿酸 Hippuric acid	W	+	W
麦芽糖 Maltose	+	+	+
半固体琼脂 Semi-solid agar	−	−	+
棉子糖 Raffinose	+	+	+
蜜二糖 Melibiose	−	+	+
D-甘露糖 D-Mannose	+	+	+
水杨素 Salicin	+	+	+
乳糖 Lactose	+	+	+
D-葡萄糖 D-Glucose	+	+	+
半乳糖 Galactose	+	+	+
苦杏仁苷 Amygdalin	−	+	+
D-海藻糖 D-Trehalose	−	+	+
鼠李糖 Rhamnose	−	−	−
YZ3为筛选菌株；LPA为模式菌株副干酪乳杆菌；LPC为商业植物乳杆菌。“+”为生长良好或阳性，“−”为不生长或阴性，“W”为微弱生长。表3同。 　YZ3, the screened strain; LPA, model strain of Lactobacillus paracasei ATCC 334; LPC, commercial Lactobacillus plantarum. “+”, good growth or positive, “−”, no growth or negative, and “W”, weak growth. This is applicable for Table 3 as well.

下载: 导出CSV 

| 显示表格

耐低温乳酸菌(YZ3)、模式菌株(LPA)和商业植物乳杆菌(LPC)的生理生化试验结果表明(表3)，3株乳酸菌均为革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性的杆状细菌，LPA和YZ3为异质发酵乳酸菌，LPC为同型乳杆菌。通过温度试验，发现YZ3和LPA在4和10 ℃条件下可以生长，在15、20、30、40 ℃条件下生长良好；LPC在4、10、15 ℃条件下缓慢生长，在20、30、40 ℃条件下生长良好；YZ3、LPA和LPC均能在3%和6.5% NaCl浓度下稳定生长；YZ3在pH为3.0、3.5、6.0时缓慢生长，在pH为4.0～5.5时生长良好；LPA与LPC在pH为3.0时不生长，LPA在pH为3.5～4.0时微弱生长，其余pH时生长良好；LPC在pH为3.5时微弱生长，其余pH时良好生长。

表  3  乳酸菌的生理生化特性测定

Table  3.  Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria

项目 Item		YZ3	LPA	LPC
形状 Shape		杆状 Rod	杆状 Rod	杆状 Rod
革兰氏染色 Gram’s stain		+	+	+
过氧化氢酶 Catalase test		−	−	−
葡萄糖产气 Gas production		+	+	−
发酵类型 Fermentation types		异型 Hetero	异型 Hetero	同型 Homo
温度 Temperature	4 ℃	W	W	W
	10 ℃	W	W	W
	15 ℃	+	+	W
	20 ℃	+	+	+
	30 ℃	+	+	+
	40 ℃	+	+	+
NaCl	3.0%	+	+	+
	6.5%	+	+	+
pH	3.0	W	−	−
	3.5	W	W	W
	4.0	+	W	+
	4.5	+	+	+
	5.0	+	+	+
	5.5	+	+	+
	6.0	W	+	+
	6.5	−	+	+
	7.0	−	+	+

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.3   耐低温乳酸菌的分子鉴定

对乳酸菌YZ3和其模式菌株的16S rRNA区域序列进行系统发育分析(图4)，根据NCBI上GenBank的搜索结果，将与乳酸菌YZ3和已知乳酸菌的16S rRNA序列进行比较，构建系统发育树，乳酸菌YZ3与模式菌株Lactobacillus paracasei R094在同一分支聚集，且进化亲缘度为100%，再结合其油镜镜检形状为杆状以及其他生理生化指标，乳酸菌YZ3鉴定为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，菌株YZ3来自红原县瓦切镇的燕麦青贮材料。

图  4  YZ3菌株系统进化树

Figure  4.  Phylogenetic tree of the YZ3 strain

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   耐低温乳酸菌对燕麦青贮品质的影响

在燕麦青贮中添加YZ3后，粗蛋白含量显著(P < 0.05)高于对照，干物质、中性洗涤纤维含量无显著变化，可溶性碳水化合物含量较对照降低5.41%，酸性洗涤纤维含量较对照升高6.1% (表4)。将YZ3添加于燕麦中进行青贮发酵，添加YZ3后pH降低至4.11，显著低于对照组5.1% (P < 0.01)，乳酸含量为63.7 mg·g⁻¹，较对照组显著升高48.10% (P < 0.01)。添加YZ3后，乙酸比对照组显著低1.28 mg·g⁻¹ (P < 0.01)，丙酸含量为0.55 mg·g⁻¹，较对照组显著降低76.69% (P < 0.01)，丁酸含量为0.1 mg·g⁻¹，较对照组降低19.2% (图5)。

表  4  添加乳酸菌对燕麦营养品质的影响

Table  4.  Effects of adding lactic acid bacteria on the nutritional quality of oats

处理 Treatment	DM/%	WSC/%	CP/%	NDF/%	ADF/%
CK	24.96 ± 0.29	5.91 ± 0.17	4.57 ± 0.05b	52.67 ± 0.37	37.12 ± 0.24
YZ3	24.11 ± 0.24	5.59 ± 0.19	5.13 ± 0.03a	51.93 ± 0.36	39.38 ± 0.61
DM，干物质；WSC，可溶性碳水化合物；CP，粗蛋白；NDF，中性洗涤纤维；ADF，酸性洗涤纤维。同列不同小写字母表示不同处理间差异显著(P < 0.05)。 　DM, dry matter; WSC, water soluble carbohydrates; CP, crude protein; NDF, neutral detergent fiber; ADF, acid detergent fiber. Different lowercase letters within the same column indicate significant differences between the different treatments at the 0.05 level.

下载: 导出CSV 

| 显示表格

图  5  添加乳酸菌对燕麦pH、氨态氮、有机酸的影响

Figure  5.  Effects of adding lactic acid bacteria on oat pH, ammonia nitrogen, and organic acid

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论

乳酸菌的生长速率与产酸速率直接影响着青贮的发酵品质，是优质乳酸菌的重要评价指标^[23-24]。作为青贮添加剂的乳酸菌菌株应具有耐酸性强、生长速度快的特征，在短时间内降低pH，抑制有害微生物的生长，而且能够广泛的利用各种糖源，在大多环境条件下均可良好生长^[25-26]。本研究从川西北地区的青贮材料以及鲜样中筛选得到的乳酸菌YZ3，其生长速率和耐酸性良好，在6.5% NaCl条件下正常生长，其与模式菌株Lactobacillus paracasei R094进化亲缘度为100%，结合菌株生理生化特性，鉴定其为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，其与Xu等^[27]筛选出的耐低温戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)相比能利用乳糖发酵，糖源利用范围较为广泛，且其低温耐受性和耐酸性均优于LPC。因此，YZ3糖源利用范围虽不如LPC和LPA，但是其更耐酸耐低温，适合作为川西北地区的乳酸菌添加剂。

低温环境对青贮品质产生影响是由于乳酸菌对外界环境的胁迫较为敏感，在燕麦中添加乳酸菌可以直接或者间接改变青贮发酵的进程，显著提高青贮料的发酵品质^[28]。有机酸含量是评判青贮品质的重要指标，其组分和含量能够反映青贮发酵品质的优劣。在燕麦青贮中，乳酸含量对pH的影响最大，在燕麦中添加乳酸菌可以直接或者间接改变青贮发酵的进程，显著提高青贮料的发酵品质^[29-30]。在本研究中，在燕麦青贮中添加乳酸菌YZ3，乳酸含量显著(P < 0.01)高于对照组，王鹏等^[31]在芦苇(Phragmites australis)中添加耐低温乳酸菌也得到了相同的结果。柴继宽等^[32]在燕麦中分别添加了耐低温的戊糖片球菌、戊糖乳杆菌和植物乳杆菌，并设置了4、10、15 ℃共3个温度梯度，发现随着温度降低，青贮饲料中的乳酸含量和乙酸含量显著降低，与对照相比，添加乳酸菌显著提高了燕麦低温青贮的青贮品质。本研究中YZ3处理的燕麦青贮中乳酸含量显著高于对照，经过添加YZ3使青贮pH显著降低，这与陆永祥等^[33]在青藏高原添加布氏乳杆菌得到的研究结果一致。丁酸作为一个对青贮品质有负面影响的物质，是丁酸梭菌分解蛋白质的产物，其不仅是营养物质流失的表现，还会产生恶臭，影响动物对饲料的采食量，而YZ3处理后能够使燕麦青贮中丁酸含量降低^[34-35]。本研究中，在燕麦青贮中添加YZ3后，粗蛋白含量显著高于对照(P < 0.05)，这与柴继宽等^[32]的研究结果一致。在本研究中，以生长速率和产酸速率作为乳酸菌的筛选指标，筛选得到副干酪乳杆菌YZ3，其在低温条件下生长快，产酸迅速，可以作为川西北地区调制青贮的备选添加菌株。

4.   结论

本研究筛选出适合川西北环境的副干酪乳杆菌YZ3，其在低温和高盐条件下生长良好且产酸能力强。添加至川西北高原燕麦青贮中，可提升发酵品质。因此，YZ3适合作为川西北高原牧草青贮的乳酸菌菌株。