随着人民生活水平的提高，人们对畜禽产品的需求日益增加，催生畜牧业快速发展，我国饲料源短缺的问题日益严重，开发非常规饲料资源迫在眉睫。桑树(Morus alba)在我国是药食两用植物，也是列入饲料目录的作物。桑叶粗蛋白含量高、粗纤维含量低、氨基酸种类丰富且富含多种活性物质^[1-5]。我国的桑树栽植面积约1 × 10⁶ hm²，年产桑叶25～30 t·hm^−2[6]。目前关于桑叶在畜禽水产饲料上的研究主要集中在探讨其最适添加量以及添加后对动物生理、生产和肉质变化等方面^[7]。有研究报道，桑叶可部分替代反刍动物饲粮中的蛋白质组分，具有较大的开发潜力^[8-11]。

瘤胃是反刍动物最重要的消化器官，是目前为止人们已知的降解纤维类物质能力最强的天然发酵体系。大量研究表明，影响瘤胃微生物区系的主要有日粮组成、动物品种、动物年龄、动物健康状况以及季节等因素^[12-17]。Li等^[18]利用宏基因组测序发现，不同日龄犊牛的瘤胃微生物区系具有显著差异。不同品种牛瘤胃微生物间也有明显差异，如牦牛瘤胃主要以降解纤维素的微生物为主，而黄牛瘤胃主要以降解淀粉的微生物为主^[19]。Tajima等^[20]利用实时定量荧光PCR发现，日粮组成的改变会降低产琥珀酸丝状杆菌的含量，升高普雷沃氏菌的含量。然而，关于桑枝叶粉对肉牛瘤胃微生物区系组成的影响还鲜有报道。

本研究将桑枝叶粉添加到云南云岭牛的饲粮中进行饲喂试验，利用高通量测序技术分析瘤胃液微生物种群多样性变化，将获得的16S rRNA基因测序数据利用PICRUSt软件预测样品中的微生物功能信息，旨在探究桑枝叶粉对瘤胃微生物组成、多样性和功能的影响。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

桑树品种为丰驰桑，产自江苏省丹阳市田园圣树蚕桑专业合作社，刈割成熟桑枝叶，经110 ℃干燥，粉碎后过0.850 mm筛，制成桑枝叶粉备用。

1.2   试验动物、日粮组成及营养水平

选用6头健康、体重为(400 ± 20) kg且安装有瘤胃瘘管的30月龄的云南云岭牛作为试验动物。在前期预试验的基础上，确定7.31%添加量对肉牛生长性能影响为最佳。根据美国国家研究委员会营养要求(National Research Council nutrient requirement, NRC) (2000)，由云南省草地动物科学研究院配制试验日粮，日粮组成及营养水平如表1所列。

表  1  试验日粮的组成及营养水平

Table  1.  Dietary composition and nutrient level

项目 Item	C组 Group C	V组 Group V
原料 Ingerdients
青贮玉米秸秆 Corn straw silage/%	87.96	81.85
桑枝叶粉 Mulberry branch and leaf powder (MBLP)/%	0.00	7.31
米糠 Rice bran/%	1.14	1.03
麦麸 Wheat bran/%	0.90	0.81
玉米 Corn/%	5.54	4.99
豆粕 Soybean meal/%	0.66	0.60
菜粕 Rapeseed meal/%	1.45	1.30
棉粕 Cottonseed meal/%	0.36	0.33
干酒糟及其可溶物 Distillers dried grains with solubles/%	0.84	0.76
大麦 Barley/%	0.60	0.54
预混料 Gunk/%①	0.24	0.22
小苏打 NaHCO3/%	0.06	0.05
食盐 Salt/%	0.18	0.16
植物油 Oil/%	0.06	0.05
合计 Total/%	100.00	100.00
营养水平 Nutritional level
代谢能 Metabolic energy/(MJ·kg−1)②	16.37	16.38
粗蛋白质 Crude protein/%	9.91	10.03
钙 Ca/%	0.12	0.25
磷 P/%	0.13	0.14
C组：对照组，V组：桑枝叶粉组，下表同。①根据美国国家研究委员会营养要求(2000)，由云南省草地动物科学研究院配制。②代谢能为计算值，方法参考何亭漪[21]，其余指标为实测值。营养物质测定以干物质为基础。 　Group C: control group, and Group V: mulberry branch and leaf powder treatment group; this is applicable for the following tables as well. ①According to the National Research Council nutrient requirement (2000), prepared by the Grassland Animal Science Research Institute of Yunnan Province. ②The metabolic energy was calculated with reference to He Tingyi[21], and the other indexes were measured. Nutrients were deermined after air drying.

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1.3   饲养管理及试验设计

本研究于2016年10月 − 2017年1月在云南省草地动物科学研究院进行，牛只进场前佩戴耳标，进行驱虫处理且定期清粪和消毒。每天08:00和18:00进行饲喂，自由饮水。试验采用自身对照法，分为对照组(C组)和桑枝叶粉组(V组)，试验期30 d，其中预饲期10 d，正饲期20 d。

1.4   样品的采集与测定

在每期试验第30天中午12:00经口腔采集瘤胃液，使用灭菌的四层纱布进行过滤并等量混合。将采集的瘤胃液分装于5 mL离心管中，保存于−80 ℃备用。冷冻样本置于冰上融化并充分混匀，使用DNA Stool Kit试剂盒提取样本的总DNA。提取得到的DNA采用NanoDrop 2000检测其浓度和纯度，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。

使用细菌V3-V4区通用引物338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')，806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')进行PCR扩增，PCR扩增采用20 μL反应体系：2 μL 10 × Buffer，2 μL 2.5 mmol·L⁻¹ dNTPs，0.8 μL Forward Primer (5 μmol·L⁻¹)，0.8 μL Reverse Primer (5 μmol·L⁻¹)，0.2 μL rTaq Polymerase，0.2 μL BSA，10 ng DNA模板，ddH₂O补齐。反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，28个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，取鉴定正确的PCR产物上机测序，测序公司为上海美吉生物医药科技有限公司，平台为Illumina MiSeq。

采用实时荧光定量技术测定瘤胃液样品中的微生物数量，所用引物如表2所列。qRT-PCR采用10 μL反应体系：4.2 μL 2 × SYB，1 μL DNA模板，0.3 μL Forward Primer (10 μmol·L⁻¹)，0.3 μL Reverse Primer (10 μmol·L⁻¹)，4.2 μL DNase/RNase-free ddH₂O。反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。qPCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。

表  2  细菌qPCR特异性引物

Table  2.  Bacterial qPCR specific primers

目标菌 Target bacteria	引物序列 (5’ – 3’) Primer sequence (5’ – 3’)	产物大小 Product size/bp	退火温度 Annealing temperature/℃
白色瘤胃球菌 Ruminococcus albus	F:CCCTAAAAGCAGTCTTAGTTCG R:CCTCCTTGCGGTTAGAACA	176	58[22]
黄色瘤胃球菌 Ruminococcus flavefaciens	F:CGAACGGAGATAATTTGAGTTTACTTAGG R:CGGTCTCTGTATGTTATGAGGTATTACC	132	58[23]
产琥珀酸丝状杆菌 Fibrobacter succinogenes	F:GTTCGGAATTACTGGGCGTAAA R:CGCCTGCCCCTGAACTATC	121	58[23]
栖瘤胃普雷沃氏菌 Prevotella ruminicola	F:GCGAAAGTCGGATTAATGCTCTATG R:CCCATCCTATAGCGGTAAACCTTTG	78	58[24]
牛链球菌 Streptococcus bovis	F:TTCCTAGAGATAGGAAGTTTCTTCGG R:ATGATGGCAACTAACAATAGGGGT	127	54[25]
溶纤维丁酸弧菌 Butyrivibrio fibrisolvens	F:CAGCAGGGAAGATAATGAC R:TGCAATACCGGAGTTGAG	171	58[26]

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1.5   数据分析

采用Excel 2013对试验数据进行初步整理，使用SPSS 20.0软件对试验数据进行单因素方差分析，组间显著性检验采用Duncan法。结果表示为平均数 ± 标准差(x ± s)，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。

2.   结果与分析

2.1   瘤胃液菌群α多样性分析

基于16S rRNA基因测序数据，绘制瘤胃液菌群样本的稀释曲线，图1中各样本曲线均已到达平台期，说明测序量已足够包含样本中绝大部分的微生物信息。由Coverage指数可知，各样本的覆盖度均达到99%，很好地反映了瘤胃中微生物群落的种类和结构多样性。本测序以97%的相似性阈值将序列划分为不同的OTU，在瘤胃液菌群中获得1 342个OTU，C组和V组共享1 288个OTU，C组独享16个OTU，V组独享38个OTU，饲喂桑枝叶粉的处理组OTU数目极显著升高(P < 0.01) (图2和表3)。在基础饲粮中添加7.31%桑枝叶粉显著提高了Ace指数和Chao指数(P < 0.05)，而Shannon指数和Simpson指数也有升高，但无显著差异(P > 0.05) (表3)。

图  1  各样本的稀释曲线

C组为对照组，桑枝叶粉浓度为0，1～6为该浓度的重复；V组为桑枝叶粉组，桑枝叶粉浓度为7.31%，1～6为该浓度的重复；图5同。

Figure  1.  Rarefaction curve of each sample

Group C was the control group, the concentration of mulberry branch and leaf powder was 0, and 1～6 were the repeats of this concentration; Group V was mulberry branches and leaves powder treatment group, the concentration of mulberry branches and leaves powder was 7.31%, and 1～6 were the repeats of this concentration; this is applicable Figure 5 as well.

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图  2  OTUs Venn图

Figure  2.  Operational taxonomic units (OTUs) Venn diagram

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表  3  瘤胃液细菌OTU数目及α多样性指数

Table  3.  Rumen bacterial operational taxonomic units (OTUs) number and alpha diversity index

项目 Item	C组 Group C	V组 Group V	P
操作分类单元 OTUs	1 065.00 ± 23.64	1 138.00 ± 28.48	0.001
覆盖率 Coverage	0.99 ± 0.00	0.99 ± 0.00	0.868
Ace指数 Ace	1 162.00 ± 11.60	1 194 ± 22.77	0.012
Chao指数 Chao	1 166.00 ± 17.74	1 203 ± 32.32	0.033
香农指数 Shannon index	5.82 ± 0.11	5.88 ± 0.12	0.391
辛普森指数 Simpson index	0.01 ± 0.00	0.01 ± 0.00	0.606

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2.2   桑枝叶粉对瘤胃液菌群相对丰度的影响

分析瘤胃液菌群在门水平的组成比例及变化，检测到19个菌门，丰度大于1%的优势菌门有7个，分别为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、黏胶球形菌门、纤维杆菌门、螺旋体门和SR1 (表4)。其在C组中的相对丰度分别为76.29%、18.66%、1.06%、0.92%、0.85%、0.58%和0.30%，在V组中的相对丰度分别为69.91%、19.00%、1.68%、2.45%、1.45%、1.19%和1.12%。两组中占比最高的均为拟杆菌门和厚壁菌门，二者占总菌群比例超过85%。在优势菌门中，与C组相比，V组拟杆菌门的丰度下降8.36% (P > 0.05)，厚壁菌门、变形菌门和纤维杆菌门的丰度分别升高1.82%、58.49%和70.59% (P > 0.05)，黏胶球形菌门、螺旋体门和SR1的丰度分别提高166.30%、105.17%和273.33% (P < 0.01)。

表  4  桑枝叶粉对瘤胃液菌群相对丰度的影响(门水平)

Table  4.  Effects of MBLP on the relative abundance of rumen bacteria (phylum level)

项目 Item	C组 Group C/%	V组 Group V/%	P
拟杆菌门 Bacteroidetes	76.29 ± 5.17	69.91 ± 5.94	0.075
厚壁菌门 Firmicutes	18.66 ± 5.11	19.00 ± 4.12	0.902
变形菌门 Proteobacteria	1.06 ± 0.48	1.68 ± 0.50	0.055
黏胶球形菌门 Lentisphaerae	0.92 ± 0.22	2.45 ± 1.00	0.005
纤维杆菌门 Fibrobacteres	0.85 ± 0.73	1.45 ± 1.53	0.411
螺旋体门 Spirochaetae	0.58 ± 0.27	1.19 ± 0.28	0.003
SR1	0.30 ± 0.09	1.12 ± 0.40	0.001
蓝细菌门 Cyanobacteria	0.22 ± 0.08	0.95 ± 0.83	0.060
软壁菌门 Tenericutes	0.34 ± 0.13	0.58 ± 0.34	0.134
疣微菌门 Verrucomicrobia	0.04 ± 0.04	0.10 ± 0.12	0.299
放线菌门 Actinobacteria	0.04 ± 0.03	0.01 ± 0.01	0.026
绿弯菌门 Chloroflexi	0.02 ± 0.02	0.00 ± 0.00	0.010
绿菌门 Chlorobi	0.00 ± 0.00	0.02 ± 0.02	0.209
Saccharibacteria	0.18 ± 0.07	0.72 ± 0.19	< 0.001
迷踪菌门 Elusimicrobia	0.14 ± 0.05	0.30 ± 0.08	0.002
浮霉菌门 Planctomycetes	0.05 ± 0.02	0.22 ± 0.09	0.001
互养菌门 Synergistetes	0.14 ± 0.11	0.11 ± 0.07	0.686
SHA-109	0.15 ± 0.15	0.10 ± 0.06	0.411
未分类Unclassified Bacteria	0.00 ± 0.01	0.09 ± 0.06	0.004

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分析瘤胃液菌群在属水平的组成及变化，共检测到182个属，主要的属有20个(表5)。与C组相比，V组中解琥珀酸菌属、拟杆菌目BS11、普雷沃氏菌属和普雷沃氏菌科UCG 003的丰度分别下降70.52%、20.88%、10.23%和30.27% (P > 0.05)，拟杆菌目RF16的丰度显著下降57.92% (P < 0.05)，拟杆菌目S24-7、普雷沃氏菌科UCG-001和理研球菌科RC9的丰度分别升高13.64%、2.81%和34.09%，但均无显著差异(P > 0.05)，丁酸弧菌属的丰度显著升高151.52% (P < 0.05)。上述9个属除解琥珀酸菌属和丁酸弧菌属属于厚壁菌门外，其余7个属均属于拟杆菌门。此外，与C组相比，V组中SR1的丰度升高273.33% (P < 0.01)；纤维杆菌属的丰度升高71.43% (P > 0.05)。属水平的分析表明，拟杆菌门各属以及厚壁菌门各属在桑枝叶粉处理组的丰度有升有降，但纤维杆菌属的丰度上升，与在门水平的分析结果一致。

表  5  桑枝叶粉对瘤胃液菌群相对丰度的影响(属水平)

Table  5.  Effects of MBLP on the relative abundance of rumen bacteria (genus level)

项目 Item	C组 Group C/%	V组 Group V/%	P
克里斯滕森菌科 R-7 Christensenellaceae R-7	1.90 ± 0.54	1.32 ± 0.10	0.026
解琥珀酸菌属 Succiniclasticum	4.24 ± 3.33	1.25 ± 1.62	0.076
拟杆菌目 UCG-001 Bacteroidales UCG-001	1.87 ± 0.75	0.72 ± 0.51	0.011
拟杆菌目 RF16 Bacteroidales RF16	2.02 ± 0.71	0.85 ± 0.62	0.012
拟杆菌目 BS11 Bacteroidales BS11	14.56 ± 3.54	11.52 ± 3.36	0.158
SR1	0.30 ± 0.09	1.12 ± 0.40	0.001
拟杆菌目 S24-7 Bacteroidales S24-7	3.30 ± 1.04	3.75 ± 1.04	0.473
纤维杆菌属 Fibrobacter	0.84 ± 0.73	1.44 ± 1.53	0.406
普雷沃氏菌科 UCG-001 Prevotellaceae UCG-001	2.85 ± 0.87	2.93 ± 0.27	0.821
黏胶球形菌门 RFP12 Lentisphaerae RFP12	0.49 ± 0.18	1.23 ± 0.96	0.094
拟杆菌属 Bacteroides	1.03 ± 0.31	0.63 ± 0.21	0.025
普雷沃氏菌属 Prevotella	28.84 ± 9.49	25.89 ± 7.97	0.573
瘤胃球菌科 NK4A214 Ruminococcaceae NK4A214	1.15 ± 0.46	1.39 ± 0.51	0.402
普雷沃氏菌科 UCG-003 Prevotellaceae UCG-003	5.22 ± 1.59	3.64 ± 1.16	0.078
瘤胃球菌科 UCG-010 Ruminococcaceae UCG-010	0.90 ± 0.32	1.04 ± 0.43	0.551
Papillibacter	1.24 ± 0.48	2.43 ± 1.15	0.041
理研菌科 RC9 Rikenellaceae RC9	11.06 ± 4.20	14.83 ± 3.43	0.119
理研菌科未分类属 Unclassified Rikenellaceae	1.82 ± 0.58	1.65 ± 0.54	0.609
普雷沃氏菌科未分类属 Unclassified Prevotellaceae	0.63 ± 0.12	0.92 ± 0.26	0.032
丁酸弧菌属 Butyrivibrio	0.33 ± 0.10	0.83 ± 0.43	0.019

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利用qRT-PCR技术分析6种瘤胃液细菌的组成(表6)。结果表明，桑枝叶粉对瘤胃液细菌群落的组成有一定的影响。与C组相比，V组中黄色瘤胃球菌数量显著下降(P < 0.05)；白色瘤胃球菌和牛链球菌数量极显著降低(P < 0.01)；溶纤维丁酸弧菌数量降低但无显著差异(P > 0.05)。产琥珀酸丝状杆菌和栖瘤胃普雷沃氏菌数量上升但无显著差异(P > 0.05)。这表明桑枝叶粉饲喂确实影响了瘤胃液的菌群组成。

表  6  桑枝叶粉对瘤胃液菌群相对丰度的影响(种水平)

Table  6.  Effects of MBLP on the relative abundance of rumen bacteria (species level)

项目① Item	C组 Group C/%	V组 Group V/%	P
白色瘤胃球菌 R. albus	4.16 ± 1.06	1.64 ± 1.80	0.002
黄色瘤胃球菌 R. flavefaciens	8.32 ± 2.28	6.50 ± 1.05	0.046
产琥珀酸丝状杆 F. succinogenes	4.57 ± 1.67	5.01 ± 2.56	0.673
栖瘤胃普雷沃氏菌 P. ruminicola	2.95 ± 0.44	3.13 ± 0.46	0.391
牛链球菌 S. bovis	1.27 ± 0.25	0.54 ± 0.28	< 0.001
溶纤维丁酸弧菌 B. fibrisolvens	2.08 ± 0.94	1.37 ± 1.01	0.143
①：细菌数以每10 ng DNA 基因拷贝数的对数表示。 　①：The number of microbes was shown by the logarithm of the values for gene copies per 10 ng DNA.

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2.3   瘤胃细菌的聚类分析

为研究不同样本菌群群落组成结构的相似性和差异关系，对样本进行聚类分析，构建样本层级聚类树。基于Unweighted UniFrac距离矩阵，使用非加权组平均法(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean，UPGMA)可视化呈现不同样本中微生物群落的差异程度(图3)，除V₄外(因此后续试验被剔除)，C组及V组组内样本各聚为一支，表明组内瘤胃微生物菌群组成相似，组间瘤胃微生物菌群组成差异较组内大。

图  3  肉牛瘤胃微生物UPGMA分析

Figure  3.  UPGMA analysis of rumen microbes in beef cattle

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2.4   PICRUSt功能预测

基于16S rRNA基因序列预测微生物群落功能，是利用PICRUSt对OTU丰度表进行标准化，然后通过每个OTU对应的greengenes ID，获得OTU对应KEGG Ortholog (KO)信息并计算其KO丰度。在KEGG第一水平，肉牛瘤胃液菌群中归类到代谢功能的OTU相对丰度最高，均大于50%，其次为遗传信息处理、环境信息处理、未分类功能以及细胞调控(图4)。在KEGG第二水平，肉牛瘤胃液微生物群落归类的主要功能类别分别是能量代谢、翻译、膜转运、复制和修复、碳水化合物代谢以及氨基酸代谢；其中氨基酸代谢OTU占比最高，超过10%，但C组和V组间无显著差异。与C组相比，V组中膜转运功能的OTU相对丰度显著升高，复制与修复功能的OTU相对丰度显著降低(P < 0.05) (图5)。在KEGG第三水平，共检测到206个KEGG通路，其中丰度排名前10的通路中，有6条涉及物质代谢，即嘌呤，嘧啶，氨糖和核糖，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，精氨酸和脯氨酸，甲烷代谢通路；2条蛋白合成通路，即核糖体和氨酰-tRNA合成通路；1条ATP结合区(ATP binding cassette, ABC)转运通路以及1条氧化磷酸化通路。且在V组中，核糖体、嘌呤代谢、嘧啶代谢、精氨酸和脯氨酸代谢4条通路的OTU丰度显著降低(P < 0.05) (表7)。

图  4  肉牛瘤胃KEGG第一水平不同功能的相对丰度

Figure  4.  Relative abundance of different functions of bacteria at the first level of KEGG in the rumen of beef cattle

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图  5  肉牛瘤胃KEGG第二水平主要功能的相对丰度

*, P < 0.05. AAM：氨基酸代谢；CM：碳水化合物代谢；RR：复制和修复；MT：膜转运；T：翻译；EM：能量代谢。

Figure  5.  Relative abundance of the main functions of bacteria at the second level of KEGG in the rumen of beef cattle

*, P < 0.05. AAM: amino acid metabolism; CM: carbohydrate metabolism; RR: replication and repair; MT: membrane transportation; T: translation; EM: energy metabolism.

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表  7  肉牛瘤胃细菌中10条丰度较高的KEGG第三水平通路

Table  7.  The ten most abundant KEGG third horizontal pathways in rumen bacteria of beef cattle

KO号 KO number	KO通路 KO pathway	C组 Group C/%	V组 Group V/%	P
KO03010	核糖体 Ribosome	4.66 ± 0.04	4.59 ± 0.06	0.044
KO00230	嘌呤代谢 Purine metabolism	3.94 ± 0.05	3.88 ± 0.04	0.041
KO00240	嘧啶代谢 Pyrimidine metabolism	3.50 ± 0.03	3.42 ± 0.05	0.006
KO02010	ABC转运体 ABC transporters	3.06 ± 0.25	3.32 ± 0.28	0.121
KO00190	氧化磷酸化 Oxidative phosphorylation	2.31 ± 0.02	2.34 ± 0.04	0.167
KO00520	氨糖和核糖代谢 Amino sugar and nucleotide sugar metabolism	2.32 ± 0.03	2.30 ± 0.02	0.299
KO00330	精氨酸和脯氨酸代谢 Arginine and proline metabolism	2.14 ± 0.01	2.11 ± 0.02	0.013
KO00970	氨酰-tRNA生物合成 Aminoacyl-tRNA biosynthesis	2.06 ± 0.02	2.07 ± 0.01	0.298
KO00250	丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 Alanine, aspartate and glutamate metabolism	2.04 ± 0.05	2.00 ± 0.04	0.138
KO00680	甲烷代谢 Methane metabolism	1.99 ± 0.08	2.02 ± 0.06	0.510

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3.   讨论

瘤胃是反刍动物重要的消化器官，瘤胃微生物在反刍动物饲料的消化和营养代谢方面发挥着重要的作用。瘤胃微生物受到多种因素的影响，其中饲粮组成是影响瘤胃微生物菌群区系最重要的因素之一。在本研究中，以饲喂基础饲粮为对照组(C组)和添加桑枝叶粉为处理组(V组)，分析桑枝叶粉添加对瘤胃液菌群组成和多样性的影响。基于16S rRNA基因序列数据分析发现，V组OTU数目、Ace指数和Chao指数显著高于C组。Ace指数和Chao指数表征菌群丰富度，数值越大，菌群丰富度越高；高丰富度的微生物群落可以使宿主对食物的分解代谢更加高效。Simpson指数和Shannon指数代表菌群多样性，本研究结果显示C组和V组间无显著差异，表明两组间菌群多样性水平相似。陈凤梅等^[27]研究表明，不同组间犊牛瘤胃微生物的α多样性无显著差异，这与本研究结果有所不同，究其原因可能是饲粮组成和动物年龄不同所致。

据报道，反刍动物瘤胃中优势菌门是拟杆菌门和厚壁菌门，与本研究结果相一致^[28-31]。虽然优势菌群均为拟杆菌门和厚壁菌门，但所占比例差异较大，其主要是受饲粮、动物品种和季节等方面所影响。拟杆菌门可降解蛋白质和多糖^[32]，提高营养摄取^[33]，增强宿主的免疫系统发育^[34-35]，维持肠道微生态平衡，促进动物的生长发育和健康。普雷沃氏菌属属于拟杆菌门普雷沃氏菌科，可对果胶、淀粉和木聚糖等植物非纤维多糖进行降解和利用^[36-37]。本研究处理组中拟杆菌门和普雷沃氏菌属丰度下降，这可能是由于桑枝叶粉中含有抑制糖代谢的活性物质，如1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin, DNJ)等，抑制了糖类物质的降解消化^[38]，从而影响有关菌群比例。DNJ是一种哌啶类多羟基生物碱，具有强效的α-葡萄糖苷酶抑制作用，能够抑制多糖和二糖的降解，影响动物对糖类的吸收，导致拟杆菌门和普雷沃氏菌属利用糖类物质效率下降，从而使其丰度降低。厚壁菌门包含瘤胃中绝大多数的纤维降解菌属，如瘤胃球菌属、丁酸弧菌属和假丁酸弧菌属，主要分解纤维类物质^[39]。本研究处理组中厚壁菌门丰度上升，丁酸弧菌属丰度显著升高，说明桑枝叶粉添加可导致促进纤维类物质降解的菌群上升，有助于动物对纤维类物质的利用。纤维杆菌门是一类革兰氏阴性细菌，其细胞周质中的纤维素酶可分解纤维素使动物能够更好地吸收。欧阳佳良等^[40]发现在精料中添加适量比例的桑叶粉能够促进瘤胃中纤维类物质的发酵。在桑枝叶粉处理组中纤维杆菌门和纤维杆菌属丰度上升，表明添加桑枝叶粉改变了云岭牛瘤胃中纤维降解菌的组成，桑枝叶粉添加饲喂可促进纤维素的降解。

由于高通量测序技术不能检测到较低水平细菌的组成变化，因此本研究采用qRT-PCR分析种水平上菌群组成变化。白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌是主要的纤维降解菌，通常具有较高的纤维降解活性^[41]。桑枝叶粉处理组中产琥珀酸丝状杆菌数量升高，且产琥珀酸丝状杆菌是数量最多的纤维降解菌，这与前人的报道相一致^[42]。溶纤维丁酸弧菌能够消化纤维素和蛋白质^[43]，栖瘤胃普雷沃氏菌和牛链球菌均属于淀粉分解菌，可利用细胞内淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖和麦芽糖。这些细菌数量的变化与门和属水平的分析结果一致。由于桑枝叶中含有多糖、黄酮和生物碱等多种活性物质，这些活性物质抑制了糖类物质的降解吸收；而添加桑枝叶粉使瘤胃中纤维降解菌群的比例升高，进而促进瘤胃中纤维类物质的降解。以上结果进一步证实了桑枝叶粉饲料影响了瘤胃液菌群的组成，促进了瘤胃中纤维类物质的降解。

PICRUSt分析通过与数据库比对，将微生物的变化情况与功能联系起来^[44]。使用PICRUSt功能预测发现，在KEGG第一水平代谢占主导地位，在KEGG第二水平氨基酸和碳水化合物代谢为主要功能类别，但在两组间均无显著差异，表明桑枝叶粉饲喂后瘤胃液细菌群落功能的功能保持相对稳定。但鉴于PICRUSt功能预测分析的局限性，不能完全代替宏基因组测序，后续研究应结合宏基因组测序进一步分析。

4.   结论

1)本研究条件下，饲粮中添加桑枝叶粉显著提高了云南云岭牛瘤胃微生物的丰富度；在门和属两个水平上，饲粮中添加桑枝叶粉导致与纤维降解有关的菌群有升高趋势，与非纤维多糖物质降解相关的拟杆菌门和普雷沃氏菌属数量下降。2) PICRUSt功能预测发现，瘤胃菌群功能主要集中在氨基酸和碳水化合物代谢。因此，在日粮中添加桑枝叶粉对瘤胃微生物群落多样性和代谢功能有积极作用，特别是纤维降解菌群比例提高，有利于促进植物纤维素的降解。