牧草品种为速达黑麦草; 黑麦草和双孢菇菌渣(主要原料为水稻秸秆和牛粪等)均由福建省农业科学院农业生态研究所提供。供试菌渣的化学性质见参考文献[11]。

1.2.1 菌渣的施用和取样方法 采用盆栽苗进行试验。底肥:将NaH₂PO₄、KCl和MgSO₄按照培养用土施用基肥P、K和Mg分别为40、50和25 kg· hm^-2换算后与土壤混合使用。施肥水平设为5个处理, 分别用CK₁、CK₂、T₁、T₂和T₃表示。CK₁施尿素量200 kg· hm^-2(相当于纯氮量93.34 kg· hm^-2)、CK₂施尿素量为0; T₁、T₂和T₃则为将菌渣按照相应的含氮量进行施用的处理:T₁相当于施纯氮量100 kg· hm^-2, T₂相当于施纯氮量200 kg· hm^-2, T₃相当于施纯氮量300 kg· hm^-2。每个处理18盆(外口径34 cm, 内口径29 cm, 高23 cm), 每盆10 kg, 均匀种植10株牧草^{[5, 6]}, 生长阶段为叶丛期。牧草按照日常管理进行。在种植10、30、60、90和120 d时进行取样, 每个处理取3盆, 将牧草轻轻拔出, 抖掉大部分土壤, 只留根部土壤, 过孔径为420 μ m筛后进行总体脂肪酸提取。

1.2.2 磷脂脂肪酸(PLFAs)的提取和检测方法 参考Frosteg a˙rd和B a˙a˙th^[19]、Kourtev等^[20]的方法进行脂肪酸的提取和分析。将15 mL的0.2 mol· L^-1的KOH甲醇溶液加入15 g土样中, 充分振荡, 37 ℃水浴1 h。加入3 mL 1.0 mol· L^-1的醋酸溶液混合均匀后, 加入10 mL正己烷振荡均匀, 800 r· min^-1离心15 min, 取下层部分, 加入体积比为1∶ 1的正己烷∶ 甲基丁基醚溶液0.5 mL, 充分溶解后转入GC小瓶。采用美国Agilent 6890N型气相色谱仪进行样品测定, 采用基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定的Sherloс kMIS 4.5系统进行脂肪酸鉴定^[21]。色谱条件为^[17]:二阶程序升高柱温, 170 ℃起始, 5 ℃· min^-1升至260 ℃, 而后40 ℃· min^-1升温至310 ℃, 维持90 s; 汽化室温度250 ℃、检测器温度300 ℃; 载气为H₂(2 mL· min^-1)、尾吹气为N₂(30 mL· min^-1); 柱前压68.95 kPa; 进样量l μ L, 进样分流比100∶ 1。以19∶ 0为内标进行PLFAs的含量标定, 参照刘波等^[17]和郑雪芳等^[21]的方法计算土壤中PLFAs的含量。

1.2.3 数据分析 利用PLFAs的种类和含量, 对菌渣施用后黑麦草根际微生物群落进行分析, 其中, 微生物总量为所有PLFAs标记的总量和; 采用16:0作为细菌的特征脂肪酸^[22], 其含量指示土壤细菌的含量; 18:1ω 9с 作为真菌的特征脂肪酸^[19], 其含量指示土壤真菌的含量, 10Me17:0作为放线菌的特征脂肪酸^[23], 其含量指示土壤放线菌的含量, 对这三大类微生物含量在黑麦草根际土壤分布的差异性进行比较, 分析菌渣对黑麦草根际土壤特征微生物分布动态的影响。采用单因子方差分析进行不同处理组PLFAs含量的显著性分析, 所用软件为DPS 7.05。

微生物群落多样性指数:按照计算物种指数的方法计算菌渣处理后黑麦草根际土壤微生物群落生态学多样性指数Shannon-Wiener(H')、均匀度指数Pielou(E)和优势度指数Simpson(C)^[21]:

H'=-∑ P_ilnP_i;

E=H/lnS;

C=1-∑ (n_i/N)².

式中:S为微生物群落中脂肪酸总的种类数, P_i=n_i/N, n_i为i类脂肪酸的个数, N为本研究中总脂肪酸个数^[21]。

施用菌渣后10和30 d时, 处理组T₁、T₂和T₃黑麦草植株根际土壤微生物PLFAs种类显著高于CK₁和CK₂组(P< 0.05)。在培养60、90 d时, 处理组T₃黑麦草植株根际土壤微生物PLFAs种类显著高于CK₁组(P< 0.05)。CK₂组黑麦草植株根际土壤微生物PLFAs种类最少, 其变化范围为25~36种。T₁、T₂和T₃处理组的PLFAs标记种类也有所不同, 其变化范围分别为37~43, 40~47和42~52种。各处理平均PFLAs种类多少依次表现为T₃(45.6种)> T₂(42.2种)> T₁(40.4种)> CK₁(32.6种)> CK₂(31.6种)(图1)。

图1

Fig.1

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图1 菌渣对黑麦草植株根际土壤微生物PLFAs种类的影响Fig.1 Effects of edible fungus residue on the microbial PLFAs species number of ryegrass rhizospere 注:不同字母表示相同培养时间不同处理间差异显著(P< 0.05)。CK1为施尿素, CK2为不施肥, T1、T2、T3均为施菌渣。下同。 Note: Different lower case letters above the column indicate significant difference among different treatments at the same time at 0.05 level. CK1, application urea; CK2, no appliction; T1, T2 and T3, application edible fungus residue. The same below.

施用菌渣后60-120 d, T₁、T₂和T₃组黑麦草植株根际土壤微生物PLFAs总量显著高于CK₁和CK₂组(P< 0.05), PLFAs总含量在8.78~15.65 mg· g^-1; CK₁组PLFAs生物总量变化幅度为3.35~6.39 mg· g^-1, CK₂组PLFAs生物总量变化幅度为2.69~7.69 mg· g^-1。在菌渣施用后的30-120 d, T₃组PLFAs总量均显著高于T₁和T₂处理组(P< 0.05), 变化幅度在10.24~15.65 mg· g^-1, 说明随着菌渣添加量的增多, PLFAs总量也增加(图2)。

图2

Fig.2

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	图2 菌渣对黑麦草植株根际土壤微生物PLFAs总量的影响Fig.2 Effects of edible fungus residue on the microbial PLFAs content of rgegrass rhizosper

菌渣施用对黑麦草植株根际土壤细菌的影响较大。在菌渣施用10-90 d时, CK₁和CK₂处理组根际土壤细菌PLFAs含量的变化趋势为持续升高。在培养90 d时, CK₁和CK₂处理组根际土壤细菌PLFAs含量最高, 分别为0.96和1.05 mg· g^-1。在培养10、30、60和120 d时, 处理组T₁、T₂和T₃根际土壤的细菌PLFAs含量显著高于对照组的(P< 0.05)。在120 d时, 处理组T₁和T₂根际土壤细菌PLFAs含量达到最高, 分别为2.31和2.78 mg· g^-1。在整个培养周期内, 施用菌渣T₃处理根际土壤细菌PLFAs平均含量最高, 是空白对照CK₂组的3.38倍, 是化肥处理CK₁组的3.61倍(图3)。

图3

Fig.3

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	图3 菌渣对黑麦草植株根际土壤细菌PLFAs含量的影响Fig.3 Effects of edible fungus residue on the soil bacteria PLFAs content of ryegrass rhizospere

在采样期间(10-120 d), 不同菌渣处理后, 黑麦草植株根际土壤真菌PLFAs含量变化趋势有所不同。T₁处理组真菌含量在120 d时达到最大, 为2.41 mg· g^-1, T₂处理组真菌含量在60 d时达到最大, 为1.55 mg· g^-1, T₃处理组真菌含量在90 d时达到最大, 为3.01 mg· g^-1(图4)。各处理黑麦草根际土壤真菌PLFAs平均含量依次表现为T₃> T₂> T₁> CK₂> CK₁。

图4

Fig.4

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	图4 菌渣对黑麦草植株根际土壤真菌PLFAs含量的影响Fig.4 Effects of edible fungus residue on the soil fungi PLFAs content of rgegrass rhizosper

不同菌渣处理对黑麦草植株根际土壤放线菌PLFAs含量的影响不同。在黑麦草的整个生长期中, T₁、T₂和T₃处理组均可以检测到放线菌, CK₂处理组仅在120 d时检测到放线菌, CK₁组在60 d和90 d时可检测到放线菌, 但是其它时期则检测不到(图5)。

图5

Fig.5

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	图5 菌渣对黑麦草植株根际土壤放线菌PLFAs含量的影响Fig.5 Effects of edible fungus residue on the soil actinomycetes PLFAs content of rgegrass rhizosper

T₁、T₂和T₃处理组放线菌含量显著高于CK₁和CK₂(P< 0.05), T₁和T₂处理组放线菌含量在120 d时达到最大, 分别为0.86和1.91 mg· g^-1, T₃处理组放线菌含量在90 d时达到最大, 为1.77 mg· g^-1。各处理黑麦草根际土壤放线菌PLFAs平均含量依次表现为T₃> T₂> T₁> CK₁> CK₂。

多样性指数是土壤微生物群落多样性的主要评价指标, 与微生物群落多样性呈正相关关系^[21]。菌渣处理后, 随着培养时间的延长, 在培养至120 d时, 黑麦草根际土壤微生物群落的Simpson、Shannon-Wiener和Pielou指数有所提高, 在整个采样周期内, T₁、T₂和T₃的平均Simpson指数分别比CK₁提高了13.33%、13.33%和17.33%, 比CK₂提高了18.06%、18.06%和22.22%。T₁、T₂和T₃的平均Shannon-Wiener指数分别比CK₁提高了21.66%、22.93%和26.75%, 比CK₂提高了25.25%、26.56%和30.49%。T₁、T₂和T₃的平均Pielou指数均比CK₁提高了14.29%, 比CK₂提高了18.03%(表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同菌渣处理黑麦草根际土壤微生物群落多样性指数 Table 1 Soil microbial species index of ryegrass rhizosphere under adding edible fungus residue 多样性指数 Diversity index 生长天数 Growing days 处理Treatment CK1 CK2 T1 T2 T3 Simpson 10 d 0.90 0.30 0.93 0.71 0.92 30 d 0.46 0.90 0.93 0.93 0.81 60 d 0.83 0.88 0.77 0.90 0.91 90 d 0.86 0.84 0.76 0.79 0.89 120 d 0.69 0.67 0.84 0.92 0.87 均值Mean 0.75 0.72 0.85 0.85 0.88 Shannon-Wiener 10 d 3.77 1.30 4.42 3.08 4.30 30 d 1.92 4.00 4.46 4.39 3.54 60 d 3.46 3.95 3.25 4.10 4.10 90 d 3.73 3.56 3.28 3.40 4.09 120 d 2.84 2.46 3.67 4.32 3.85 均值Mean 3.14 3.05 3.82 3.86 3.98 Pielou 10 d 0.81 0.28 0.85 0.58 0.78 30 d 0.39 0.83 0.83 0.81 0.66 60 d 0.69 0.77 0.62 0.77 0.76 90 d 0.72 0.69 0.60 0.64 0.72 120 d 0.55 0.48 0.68 0.78 0.70 均值Mean 0.63 0.61 0.72 0.72 0.72

表1 不同菌渣处理黑麦草根际土壤微生物群落多样性指数 Table 1 Soil microbial species index of ryegrass rhizosphere under adding edible fungus residue