第一作者:孙清洋(1988-),男,山东淄博人,在读硕士生,研究方向为牧草种质资源鉴定评价与创新利用。E-mail:[email protected]
为研究不同老芒麦( Elymus sibiricus)种质材料耐盐性表现,以筛选出耐盐品种,为耐盐老芒麦种质材料育种提供科学支撑,采用不同浓度梯度NaCl溶液(0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%和1.8%)模拟盐胁迫,对9份来自全国不同地区的老芒麦种质材料进行耐盐处理,筛选出老芒麦萌发期适宜浓度,分别测定其萌发指标及幼苗叶片生理指标(脯氨酸、超氧化物歧化酶、丙二醛),分析不同浓度胁迫下指标的变化情况,并对9份老芒麦的耐盐性进行综合评价。结果表明,NaCl胁迫对老芒麦种子的相对发芽率、发芽指数均产生抑制影响,抑制了胚根与胚芽的生长,其叶片中超氧化物歧化酶活性、丙二醛及脯氨酸含量对盐胁迫浓度变化响应灵敏,0.9%NaCl盐浓度为合适的萌发期筛选浓度,根据隶属函数法进行综合评价,9份老芒麦材料耐盐性由强到弱依次为E03、E04、E08、E09、E07、E05、E06、E02和E01。
The aim of this study was to evaluate the salt resistence of different Elymus sibiricus germplasm and to screen varieties with salt resistance. The seeds of nine E. sibiricus were treated with different NaCl solutions of 0, 0.3%, 0.6%, 0.9%, 1.2%, 1.5% and 1.8%, to select the best concentration of NaCl solution. The salt stress of nine accessions was studied in germination index and seedling leaf physiological indexes. The results of this study showed that the salt decreased the relative germination rate and relative germination index, inhibited the growth of radicle length and plumule length. It was obvious that the level of SOD enzyme activities, MDA, proline in the leaves at seedling stage were sensitive to the level of salt stress. The concentration of 0.9% NaCl was suitable for screening salt tolerance in E. sibiricus at seed germination stage. According to the descending order of the comprehensive evaluation of salt resistance, the order of nine E. sibiricus accessions from high to low was E03, E04, E08, E09, E07, E05, E06, E02, E01.
土壤盐碱化是阻碍世界农业发展的主要生态因素之一, 严重限制了作物生长, 对作物的产量和品质影响显著[1]。目前, 盐碱地约占世界陆地总面积的10%左右, 达9.5亿hm2[2], 我国是盐碱地大国, 盐碱地分布范围广, 其中东北半湿润-半干旱-草甸盐渍区与西藏高寒漠境区多以草甸沼泽土为主; 青、新极端干旱漠境区、内蒙古干旱-半漠境草原区因降水量小, 蒸发量大, 干旱程度重, 溶解在水中的盐分容易在土壤表层积聚, 其盐渍强度也较高。不同植物在不同生长阶段对于盐胁迫的应激反应是有差异的, 因此, 筛选培育耐盐新品种已经成为开发利用盐渍化土壤的最有效途径。植物的萌发期是决定其能否在盐胁迫下完成整个生育过程的关键时期, 其发芽状况、胚根胚芽的生长等都为植物以后的生长和发育起决定性的作用[3, 4]; 是进行植物耐盐性早期鉴定及耐盐品种早期选择的基础[5]。
老芒麦(Elymus sibiricus)为禾本科小麦族披碱草属多年生疏丛型中旱生植物[6], 具有适应性强、抗寒、抗旱和耐盐等特性, 在草地畜牧业中发挥了巨大作用[7, 8], 对于开发利用盐碱地资源具有重要的意义。目前, 关于老芒麦耐盐性的研究主要集中在禾本科不同牧草与老芒麦材料之间的比较[9, 10, 11, 12], 关于老芒麦耐盐性鉴定、耐盐性机理等方面的研究报道较少。本研究通过对9份老芒麦种质材料在不同NaCl浓度下其萌发及生理指标的全面测定, 综合评价其耐盐性, 旨为老芒麦的耐盐育种提供亲本材料, 为培育老芒麦新品种奠定基础。
供试材料由中国农业科学院草原研究所国家种质牧草中期库提供, 老芒麦种质资源材料来源于中国的8个省(市、自治区)以及俄罗斯。采集地包括西藏高寒漠境盐渍区, 黄河中上游干旱-半漠境盐渍区, 内蒙古高原干旱-半漠境草原盐渍区, 东北半湿润-半干旱草原、草甸盐渍区, 青、新极端干旱漠境盐渍区等地, 地理来源及编号详见表1。
试验于2015年3月在农业部沙尔沁牧草资源重点科学观测试验站试验温室中进行, 人工温室温度控制在27~30 ℃, 湿度控制在58%~62%。采用培养皿纸上发芽法, 用铺有两层滤纸直径9 cm培养皿做发芽床, 选取成熟饱满、均匀一致的老芒麦种子, 经1%的次氯酸钠溶液消毒5 min后, 每皿放入50粒种子进行试验, 分别加入等体积的浓度为0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%和1.8%的NaCl溶液进行盐胁迫处理。每个浓度4个重复, 以蒸馏水作为对照。每日16:00―20:00用称量法根据水分蒸发量加入蒸馏水以维持盐浓度, 在人工光照培养箱中培养, 恒温25 ℃, 相对湿度(70± 5)%, 光照间隔12 h, 第2天开始观察并记录老芒麦种子萌发情况, 第8天统计发芽率。
将老芒麦种子放在铺有双层滤纸的培养皿中, 发芽后移入人工温室内装有风干苗圃土的花盆中, 花盆与土重量共计2.5 kg。花盆高14 cm, 内径18.5 cm, 底径12.5 cm。每盆定株10株, 3次重复。苗圃土含盐量极低, 可以忽略不计。待幼苗长到40 d分蘖期时, 将分析纯氯化钠溶解于定量的蒸馏水中, 处理盐浓度分别为0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%和1.8%, 每个处理4个重复, 并以空白处理为对照。处理期间每2 d称花盆重量, 用蒸馏水补充蒸发水分, 以保持盐浓度。
1.3.1 萌发指标的测定 每天统计发芽种子数(以胚根至少与种子等长, 苗高不短于种子直径的1/2为发芽标准), 第2天开始记录种子萌发情况, 第8天测定发芽率并计算其相对发芽率, 随机取10株萌发幼苗测定其胚根长和胚芽长, 并计算相对胚根长和相对胚芽长。根据公式计算[13, 14]:
相对发芽率=处理种子发芽率/对照种子发芽率× 100%;
发芽指数=∑ (Gt/Dt);
式中:Gt为t天的发芽率; Dt为相应的天数。
相对发芽指数=处理种子发芽指数/对照种子发芽指数× 100%;
相对胚根长=处理种子胚根长/对照种子胚根长× 100%;
相对胚芽长=处理种子胚芽长/对照种子胚芽长× 100%。
1.3.2 生理指标的测定 脯氨酸(Pro)含量测定采用酸式茚三酮法[15], 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)法[16], 以抑制NBT光化还原的50%为1个酶活性单位表示, 丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)法[17]。
应用隶属函数法对老芒麦种子萌发期耐盐性进行综合评价。先利用公式X(μ )=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)计算每份材料的相对发芽率、相对胚根长等具体隶属函数值[18]。式中, X为参试材料某一指标的测定值, Xmax和Xmin分别为所有材料中该指标的最大值和最小值, 将各项指标隶属函数值累加, 求其平均值为综合评价值。根据各材料平均隶属函数值大小确定其耐盐性强弱。
采用Excel作图, 数据以“ 平均值± 标准误” 表示, 用SPSS18.0软件进行方差分析及相关性分析, 用隶属函数法评价各供试材料的耐盐性强弱。
随着盐浓度的增加, 9份材料的相对发芽率大都呈下降趋势, 不同来源的老芒麦种子发芽率对盐胁迫的响应不同(表2), 处理组E03、E04、E08在0.3%盐浓度时的相对发芽率高于对照, 其中E03与对照相比差异显著(P< 0.05); 其它6份材料随着NaCl浓度的升高, 相对发芽率呈依次降低趋势。NaCl浓度为0.6%时, 处理组E02、E05、E06、E07、E09相对发芽率低于对照组且与之差异显著(P< 0.05); NaCl浓度为0.9%时, 不同供试材料之间相对发芽率差异较大, E04相对发芽率最大, 为89.00%, E01、E06相对发芽率则低于50%, 表明0.9%盐浓度对供试材料相对发芽率影响较大; 当NaCl浓度> 0.9%时, 除E08外, 其它材料相对发芽率均显著低于0.9%处理组; 在NaCl浓度为1.8%时, 处理组E06的相对发芽率降幅最大, 其相对发芽率为0, 降幅最小的是E04, 相对发芽率为28.67%。
各材料种子相对发芽指数随着盐浓度的增加大都呈下降趋势(表3), 在NaCl浓度为0.3%时, 处理组E01、E02、E04、E05、E06、E07、E08低于对照且与之差异显著(P< 0.05), E03、E09与对照相比差异不显著(P> 0.05); 除处理组E01、E02外, 其它材料在NaCl浓度为0.3%时发芽指数均高于其它高浓度盐处理。与对照相比, 1.8%NaCl处理下的E09相对发芽指数下降幅度最小, 为81.00%, E01相对发芽指数降幅最大, 为90.67%。
处理组E01、E04、E07、E09幼苗的相对胚根长随着NaCl浓度的增加表现为先升后降的趋势(表4), 在NaCl浓度为0.3%时, 这4份材料相对胚根长均高于对照, 但与对照相比差异不显著(P> 0.05); 其中E09相对胚根长最高, 为116%, 显著高于其它材料(P< 0.05), 其它材料均随着NaCl浓度的增加而下降。当NaCl的浓度≥ 0.9%时, 所有材料相对胚根长均显著低于对照(P< 0.05)。与对照相比, 1.8%NaCl浓度处理下的E05的相对胚根长降幅最大, 为81.78%, E09的相对胚根长降幅最小, 为46.20%。
随着NaCl浓度的不断升高, 处理组 E03、E08、E09的相对胚芽长出现先升高后下降的现象(表5), 与对照相比, 在NaCl浓度为0.3%时, E03、E08、E09相对胚芽长高于对照, 且差异显著(P< 0.05); 其它材料相对胚芽长显著低于对照(P< 0.05)。与对照相比, 在1.8%NaCl处理下, E05的相对胚芽长降幅最大, 达76.95%; E04的相对胚芽长下降幅度最小, 为61.11%。
SOD是植物体内保护细胞膜并免受自由基伤害的重要物质, 其活性的高低能够反映植物自身的修复能力, 活性越高则说明其修复能力越强, 植物忍耐和抵抗逆境胁迫的能力越强。9份老芒麦种质材料随着NaCl 浓度的不断升高, 其活性出现先升高后降低的现象(表6)。当盐浓度在0.3%~0.9%时, 各供试材料SOD活性变化幅度较小, 说明老芒麦幼苗对低浓度盐胁迫有一定耐盐能力。随着盐胁迫的加剧, 当盐浓度为1.2%时, 除E02外, 各供试材料SOD活性显著增加, 与对照相比差异显著(P< 0.05); 除E02、E08外, 其它材料的SOD活性均达到最大值, 说明1.2%NaCl是其最佳耐受盐度。当盐浓度在1.5%~1.8%时, 不同材料SOD活性显著降低, 这可能与其自身特性有关, 当盐浓度超过其耐受盐浓度的” 阙值” , 其自身防御系统被破坏, 导致SOD酶活性显著降低; E08的SOD活性变化幅度最大, 说明其对盐胁迫的敏感度最大。
随着盐胁迫强度的加剧, 各老芒麦种质材料的叶片中丙二醛(MDA)的含量均出现不同程度的升高(表6), 当NaCl浓度在0~0.6%时, 各供试材料叶片中MDA含量增加, 但其变化幅度较小, 当NaCl为0.9%时, 各处理组MDA含量明显增加, 与对照相比均差异显著(P< 0.05), 其中处理组E01变化幅度最大, 为对照的2.23倍; 在盐浓度为1.8%时, 除E07外, 各处理组叶片中MDA含量均达到最高值; 其中E09最大, 为35.55 nmol· g-1, 所有材料中E08变化幅度最小, 其叶片中MDA含量是对照的1.77倍, 说明其具有较强的耐盐能力。
在正常生长条件下, 老芒麦脯氨酸含量较低, 但在逆境条件下, 脯氨酸含量会大量累积。随着盐浓度的升高, 各老芒麦种质材料叶片中脯氨酸含量不断递增(表6)。用1.2%NaCl浓度处理后, 各处理组老芒麦种质材料脯氨酸含量出现大幅度的上升, 且与对照相比差异显著(P< 0.05)。在盐浓度为1.8%时, 各处理组中脯氨酸含量均达到最大值, 其中E06变化幅度最大, 脯氨酸含量为1 009.21 μ g· g-1, 说明其对盐胁迫比较敏感; E08脯氨酸含量是对照的3.72倍, 增加幅度最小, 表明该材料耐盐性较好。
植物的耐盐表现是涉及到生理、生化等多方面的综合反应。不同耐盐指标间必然存在一定的相关性, 这种相关性有助于进一步了解老芒麦耐盐性。通过对老芒麦耐盐指标的相关性分析发现(表7):大多数性状间的相关性均达到了极显著水平(P< 0.01)。其中相对发芽率与相对发芽指数相关性极显著, 相关系数达到0.935。相对发芽指数与相对胚芽长相关性极显著, 相关系数为0.903, 相对胚芽长与相对发芽率的相关系数也达到0.921。SOD活性与丙二醛含量相关性也极显著(P< 0.01)。
由NaCl浓度对供试材料的相对发芽率、相对胚根长、SOD等7项指标的影响可知, 0.9%浓度NaCl盐溶液对老芒麦萌发期影响显著, 可以作为老芒麦芽期耐盐性材料筛选的最适处理浓度。采用隶属函数法对供试9份老芒麦种质材料的相对发芽率、相对发芽指数等7个指标进行隶属函数值计算, 结果表明, 耐盐性强弱顺序依次为 E03> E04> E08> E09> E07> E05> E06> E02> E01(表8)。
盐胁迫是一种普遍的非生物胁迫, 在整个植物生长和发育过程中是主要的限制性环境因素[19, 20]。植物对盐胁迫的反应可能是复杂的系统性过程, 其耐盐能力是多种代谢的综合体现。采用6个不同浓度NaCl溶液对不同来源的芒属(Miscanthus)植物种子胁迫的研究表明, 随着NaCI溶液浓度的升高, 芒属植物种子的相对发芽率、发芽指数等萌发指标均呈下降趋势[21]。本研究结果表明, 随着盐浓度的升高, 老芒麦种子的相对发芽率、相对发芽指数均大都呈现下降趋势, 但在低浓度胁迫下, E03、E08的相对发芽率高于对照, 出现这种现象可能是低浓度盐胁迫会促进老芒麦的种子的某些萌发过程, 这与窦声云等[11]的研究结果一致。
植物处于盐逆境胁迫下, 植物体内通过提高自身抗氧化系统活性来平衡失衡的活性氧代谢[22]。采用不同NaCl浓度对高寒老芒麦进行胁迫研究[23], 结果显示SOD、CAT活性随着NaCl浓度的增加, 在150 mmol· L-1胁迫时活性达到最大, 而后呈现降低趋势。本研究中, 随着盐胁迫程度的升高, 在1.2%NaCl浓度下, SOD活性达到峰值, 随后不断下降, 同时随着NaCl浓度的不断升高, 老芒麦叶片中的脯氨酸和丙二醛含量也随之不断的上升, 以降低细胞的渗透势, 应对不利的逆境环境。
本研究选择来自全国不同盐渍地区的9份老芒麦种质作为试验材料, 在0.3%~1.8%NaCl盐浓度下进行耐盐性鉴定, 结果显示, 在0.9%NaCl处理下, 不同材料间的相对发芽率、相对发芽指数、相对胚根长、相对胚芽长的差异最明显, 而在其它浓度处理下, 各材料之间的差异性不大, 说明本研究中0.9%NaCl浓度是进行老芒麦萌发期耐盐性鉴定的筛选浓度。
选择不同的指标对种质材料萌发期耐盐性强弱评价时, 得到的结果可能并不完全一致。本研究采用隶属函数值对9份老芒麦种质材料的相对发芽率、超氧化物歧化酶活性等7个指标进行综合分析, 能够客观地反映出植物的耐盐能力, 结果显示, 9份老芒麦种质材料耐盐性强弱次序依次是E03、E04、E08、E09、E07、E05、E06、E02、E01。
植物耐盐性是由多因素相互作用而形成的一个较为复杂的生态生理响应过程, 同一植物不同生育期对于盐胁迫的响应能力是不同的[24]。本研究在老芒麦萌发期与苗期对供试的9份老芒麦材料进行了耐盐性综合评价, 其中E03、E04、E08耐盐性综合排名前三, 表现为较强的耐盐性, 可以应用于耐盐栽培, 为老芒麦耐盐品种的选育提供了材料。
The authors have declared that no competing interests exist.
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