引用本文
郭志慧, 杨红宇, 张成林, 孙铭, 符开欣, 张新全, 马啸. 利用形态性状以及SSR标记鉴定4个川西北老芒麦品种(系). 草业科学, 2016,33(9):1718-1727
Guo Zhi-hui, Yang Hong-yu, Zhang Cheng-lin, Sun Ming, Fu Kai-xin, Zhang Xin-quan, Ma Xiao. Identification of four Elymus sibiricus cultivar (strains) from Northwest Plateau of Sichuan using morphological traits and SSR markers . Pratacultural Science,2016,33(9): 1718-1727  
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利用形态性状以及SSR标记鉴定4个川西北老芒麦品种(系)
郭志慧, 杨红宇, 张成林, 孙铭, 符开欣, 张新全, 马啸
四川农业大学动物科技学院草业科学系,四川 成都 611130
通信作者:马啸(1977-),男,山东济宁人,教授,博士,主要从事草种质创新与育种研究。E-mail:[email protected]

第一作者:郭志慧(1989-),女,内蒙古武川人,在读硕士生,主要从事草种质创新与育种研究。E-mail:[email protected]

收稿日期: 2016-02-26
基金: 国家科技支撑计划(2011BAD17B03); 四川省科技支撑计划(2013ZC1635); 国家自然科学基金(31101763)
摘要

基于23个形态性状和SSR分子标记,对在川西北推广应用的老芒麦( Elymus sibiricus)3个国审品种(‘川草2号’、‘阿坝’和‘康巴’)及1个新品系(‘雅江’)进行了鉴定研究。各品种表型性状与遗传背景差异较明显。新品系‘雅江’表现出优良的农艺性状,株高、叶长、叶宽、茎粗等形态性状均值显著优于3个对照品种( P<0.05)。13对多态性好、特异性强、条带清晰的SSR引物在4个品种(系)中共扩增出90条条带,其中具有多态性的条带共68条,引物多态性条带比例(PPB)、多态性信息含量(PIC)及Shannon多样性指数(H)的平均值分别为76.32%、0.309及0.451,在供试品种(系)中均表现出较高的多态性。基于形态数据的欧氏距离和基于SSR数据的遗传距离矩阵之间具有较强的相关性( r=0 .696, P=0.08),表明联合形态学标记和遗传标记能很好地用于品种鉴定,并且基于形态数据以及SSR分子标记的UPGMA聚类结果基本一致。筛选出4对引物可用于供试品种鉴定,并绘制了DNA指纹图谱。新品系‘雅江’具有明显区别于其它3个主推品种的形态特征和遗传背景,这为川西北高原老芒麦主要品种的遗传关系分析及品种的知识产权保护提供了数据支撑。

关键词: 老芒麦; 形态性状; SSR标记; 品种鉴定; 指纹图谱
中图分类号:S543+.9 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2016)9-1718-10 doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0664
Identification of four Elymus sibiricus cultivar (strains) from Northwest Plateau of Sichuan using morphological traits and SSR markers
Guo Zhi-hui, Yang Hong-yu, Zhang Cheng-lin, Sun Ming, Fu Kai-xin, Zhang Xin-quan, Ma Xiao
Department of Grassland Science, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
Corresponding author: Ma Xiao E-mail: [email protected]
Abstract

Based on 23 morphological traits and SSR markers, three cultivars (Chuancao No. 2, Aba and Kangba) and a new strain (Yajiang) of Elymus sibiricus widely utilized in Northwest Plateau of Sichuan were identified. There was obvious difference among varieties at phenotypic traits and genetic background. Morphological traits were measured, includingplant height, leaf length, leaf width, Culm diameter and so on, the new strain ‘Yajiang’ had betterperformance in major agronomictraits than that of other three varieties ( P<0.05). Furthermore, 13 screened pairs of SSR primerwere amplified in four cultivars (strains) and generated 90 bands, of which 68 bands were polymorphic. According to the mean of percentage of polymorphic bands (PPB=76.32%), polymorphism information content (PIC=0.309) and Shannon diversity index (H=0.451), four cultivars (strains) presented high polymorphism. A positive correlation ( r=0 .696, P=0.08) existed between Euclidean distance and Dice genetic distance, indicating that the combination of morphological traits and genetic markers could be used for cultivar identification. Two UPGMA dendrogram based on morphological and SSR data were similar and there were differences among all cultivars (strains) for phenotypic and genetic background. Furthermore, four pairs of primers (Elw0669s043, Xgwm190, WMS169 and Xgwm311) were selected for DNA fingerprinting construction and cultivar identification. In general, the present study demonstrated that the new strain ‘Yajiang’ was significantly different from other three E. sibiricus cultivars, and provided important data for genetic relationship analysis and intellectual property rights protection for cultivars in the Northwest Plateau of Sichuan.

Keyword: Elymus sibiricus; morphological traits; SSR marker; cultivar identification; DNA fingerprinting

老芒麦(Elymus sibiricus)是禾本科(Gramineae)披碱草属多年生的疏丛型优良牧草, 为异源四倍体, 具有StStHH的染色体组构成[1]。在我国主要分布在新疆、内蒙古和青藏高原等地区[2]。老芒麦对寒冷干旱气候具有良好的生态适应性, 并且具有优质、高产的特性[3], 在草甸草原、草甸群落中能形成优势种以及建群种[4], 广泛用于放牧、栽培草地建植及牧草改良育种等, 已经成为青藏高原地区栽培利用最为广泛的当家草种之一, 在草地畜牧业中发挥了巨大作用[5]。

老芒麦为自花授粉植物, 但其异交率较高[6], 而且对于多年生牧草而言, 品种群体内的纯度或表型整齐度比不上大麦(Hordeum vulgare)、燕麦(Avena sativa)等自花授粉作物, 而是更加强调其牧草产量和适应性等方面, 故而单株选择、混合选择和集团选择均是老芒麦常用的育种方法。截至2015年, 通过全国牧草品种审定委员会已经审定登记了8个老芒麦品种, 随着品种数量越来越多, 品种的真实性鉴定对于种子产业发展和知识产权保护愈发重要。鉴定栽培品种、品系等在内的优异育种材料间的遗传关系及多样性是植物育种的重要基础性工作。一般而言, 牧草品种鉴定是指通过比较送验样品或田间植株与所属种(或属)以及品种的符合程度来判断[7]。主要包括品种的真实性和品种纯度[8]。而品种真实性是指样品是否名实相符, 这是品种鉴定的首要内容, 也是进行纯度检测的基础[8]。由于品种群体内变异的存在, 导致老芒麦品种的鉴定不像小麦(Triticum aestivum)、水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)等纯系品种利用单株进行鉴定方便。另外, 老芒麦品种大多从野生种质材料驯化而来, 其育种的原始材料很有可能在野外与已经大面积在退牧还草等生态项目中大规模推广使用的已有老芒麦品种发生杂交, 或者原始材料就是已有品种的某些变异单株构成, 这样最终导致不同的育种原始材料遗传关系相近, 造成不同品种的遗传基础狭窄, 增加了品种鉴定的难度。20世纪90年代, 我国正式加入《国际植物新品种保护公约》, 涉及植物品种权争议和育种者权益保护的事例逐年增加, 而权威、稳定的检测方法对植物新品种准确鉴定及保护具有重要意义。

DUS(distinctness, uniformity, stability)测试是由国际植物新品种保护联盟(International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV)提出, 即植物品种特异性、一致性和稳定性, 主要通过测定植物部分表型性状来描述和鉴定品种[9]。但是表型鉴定所需周期长, 性状多, 易受环境因子、栽培条件和个体发育的影响, 对遗传变异的检测有限, 不能满足种质资源鉴定和品种工作的需要[10]。DNA分子标记的发展, 极大地弥补了形态学标记的不足, 其中, 简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)标记具有多态信息含量高、重复性好、引物设计简单及共显性遗传的特点, 是植物指纹图谱构建及品种鉴定的首选方法[11, 12]。为此, 本研究有效地结合表型性状及SSR等分子标记, 通过合理的统计方法, 比较不同品种间表型及遗传的差异, 为更好地了解品种的适应性及其推广应用提供了理论支持。

本研究选取了利用川西北高原野生种质选育而成的3个老芒麦品种(‘ 阿坝’ 、‘ 川草2号’ 及‘ 康巴’ )和1个老芒麦新品系(‘ 雅江’ 老芒麦), 采用形态学标记以及SSR分子标记, 鉴定不同老芒麦品种(系)在表型及分子水平上的多态性, 以期为川西北高原老芒麦品种知识产权保护提供一些理论依据。

1 材料与方法
1.1 供试材料

本试验选取3份老芒麦国审品种, ‘ 川草2号’ 老芒麦、‘ 阿坝’ 老芒麦、‘ 康巴’ 老芒麦以及1份新品系‘ 雅江’ 老芒麦(表1), 供试材料2012年种植于四川省草原科学研究院红原县试验地, 随机区组设计, 每个品种(系)4次重复, 小区面积6 m2(3 m× 2 m), 每小区种植12株, 株行距均为1 m。

表1 供试的老芒麦品种(系) Table 1 Elymus sibiricus cultivars (strains) in the experiment
1.2 形态性状测定

在植株抽穗期(2014年7月-8月), 每个品种的每个小区随机抽取5株, 共观测20个单株, 每个单株随机取3个分蘖枝进行重复观测, 测定方法参照《老芒麦种质资源描述规范和数据标准》[13]。共测量23个形态性状指标(表2)并求出其均值及标准差。

表2 4个老芒麦品种(系)形态性状均值及标准差 Table 2 The mean value and standard deviation of phenotypic traits of four Elymus sibiricus cultivars (strains)
1.3 SSR分子标记

1.3.1 基因组DNA提取 基因组DNA提取采用混合单株 DNA 样本 (bulked samples) 进行, 每个品种选取30个单株的叶片等量混合[8], 参照Doyle[14]描述的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法, 使用植物基因组DNA提取试剂盒(DP305, 北京天根)提取基因组DNA, 利用超微量分光光度仪(Nano 2000)检测DNA的纯度和浓度, 经检测合格的DNA样品保存于-20 ℃冰箱中备用。

1.3.2 SSR-PCR扩增及电泳检测 引物参考前人已发表的老芒麦(ESGS)[15]、披碱草属物种(Elw)[16]及小麦(Xgwm, WMS)[17]的SSR和(或)EST-SSR序列, 并由成都金杰生物技术有限公司合成165对引物。SSR-PCR扩增体系和反应程序主要参照Rö der等[17], PCR扩增体系优化为15 μ L:模板DNA 3 μ L(10 ng· μ L-1), 上下游引物各0.8 μ L(5 pmol· μ L-1), Mix混合液7.5 μ L(含有10× PCR buffer、Mg2+、dNTPs)(北京天根科技生化公司), Taq酶0.4 μ L(2.5 U· μ L-1)(北京天根科技生化公司), 其余用ddH2O补足。在Bioradicycle PCR仪上进行PCR扩增, 扩增程序为:94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性30 s, 49~60 ℃(退火温度根据不同的引物进行设置)变性30 s, 72 ℃延伸1 min, 共35个循环; 72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺:甲叉=19:1)用1× TBE缓冲液进行垂直电泳分离, 150 V电泳0.5 h, 400 V电压电泳约3 h, 电泳结束后进行银染和照相保存。

1.4 数据统计与分析

表型性状数据利用Excel 2016和SPSS 19.0软件求出均值、标准差, 并将表型性状的数据进行标准化处理后计算出各品种间的欧氏距离(Euclidean Distance, ED)。由于老芒麦为异源四倍体, SSR分子标记可能导致扩增位点不止一个, 并且难以使用基因分型方法统计, 而为保证结果的稳定性, 试验采用混合单株 DNA 样本的原则, 仅统计符合期望扩增片段分子量附近的强带, 并在相同迁移位置有带记为 1, 无带记为 0, 形成原始数据矩阵。统计扩增条带总数(total number of bands, TNB)及多态性条带数(number of polymorphic bands, NPB), 并计算多态性条带比例(percentage of polymorphic bands, PPB)、Shannon多样性指数(Shannon diversity index, H)[18]及多态性信息含量(polymorphism information content, PIC)[19]。对形成的二元数据矩阵用Dice系数[20]估算各品种间的遗传相似性(GS), Dice系数实际上等同于Nei和Li[21]遗传相似系数, Nei-Li遗传距离(GD)=1-GS。

基于形态性状的欧氏距离(ED)及SSR分子标记的遗传距离(GD), 采用非加权配对算数平均法(UPGMA), 使用NTSYS-pc 2.10软件[22]分别绘制树状关系图。使用Winboot软件[23]基于bootstrap分析(9999次置换)来检验树状图的可靠性。同时使用TFPGA软件[24]用Mantel test[25](9999次置换)对由形态学指标计算所得的欧氏距离矩阵和SSR遗传距离矩阵之间的相关性进行检测。

2 结果与分析
2.1 老芒麦品种(系)形态学标记结果

2.1.1 表型性状的多样性分析 由形态性状统计分析的结果(表2)可以看出, 老芒麦品种(系)的形态特征存在差异。比较均值发现:旗叶长、倒二叶长、茎杆间数、茎节间长、穗宽、穗轴节间长、穗轴节小穗数、第1颖长、第1颖宽及外稃长这10个性状均以‘ 雅江’ 老芒麦最大; 倒二叶宽、旗叶与穗基部长度、茎粗、穗长、小穗含小花数、外稃宽、外稃芒长、第1颖芒长和穗轴节数这9个性状以‘ 康巴’ 老芒麦最大; ‘ 川草2号’ 老芒麦的株高、小穗长及小穗宽3个性状优于其他品种。同时, 为更好地了解不同品种(系)之间的遗传多样性以及显著性差异, 采用方差分析方法, 其结果显示(表2), 23个表型性状中仅有3个性状(旗叶宽、穗轴节数和小穗长)差异不显著, 其余性状均为显著或极显著, 不同老芒麦品种(系)之间存在较大差异。

2.1.2 形态特征聚类分析 基于品种(系)23个性状的欧氏距离(ED), 采用UPGMA法对4个老芒麦品种(系)的形态性状数据进行聚类分析, 构建聚类图(图1)。并以欧氏距离的平均值(ED=4.8)为截值, 可将4份种质分为三大类群。其中, ‘ 阿坝’ 和‘ 川草2号’ 老芒麦聚为一类, 剩下两个品种(系)分别为单独一类。结果说明, ‘ 阿坝’ 和‘ 川草2号’ 老芒麦品种亲缘关系更近, 两者在形态性状之间差异相对更小, 单纯从形态性状可能很难区分, 而‘ 康巴’ 老芒麦与其他3个品种的遗传距离最远。

图1 基于形态数据的4个老芒麦品种(系)的树形图Fig. 1 Dendrogram of cluster analysis of four Elymus sibiricus cultivars (strains) based on morphological data

2.2 老芒麦品种(系)SSR标记分析

2.2.1 SSR标记多态性分析 从165对SSR引物中筛选出13对多态性好、特异性强、条带清晰的引物(表3), 并对4个老芒麦品种(系)进行SSR-PCR扩增, 共扩增出90条带, 平均每对SSR引物扩增的条带为6.923条, 其中具有多态性的条带共68条, 多态性条带比例(PPB)在60%~100%, 平均为76.32%, 其中, WMS169和Xgwm190的多态性比率为100%(表3)。各引物等位位点多态性信息量(PIC)在0.188~0.450, 平均值为0.309; 引物的Shannon多样性指数(H)在0.281~0.641, 平均值为0.451。结果表明, SSR分子标记在老芒麦中具有良好的多态性, 也说明该标记是用于分析老芒麦品种(系)遗传变异或进行种质鉴定的有效工具。

表3 4个老芒麦品种(系) SSR的扩增结果 Table 3 The various statistics of SSR amplified results for four Elymus sibiricus cultivars (strains)

2.2.2 SSR标记聚类分析 为进一步了解不同品种(系)之间的遗传关系, 计算得到品种(系)的Nei-Li遗传距离(GD), GD变异范围在0.140(‘ 川草2号’ vs. ‘ 阿坝’ )~0.500(‘ 康巴’ vs. ‘ 雅江’ ), 平均值为0.335。基于相似性系数, 采用UPGMA法进行聚类分析(图2), 在GD为0.335的水平下, 供试材料可分为两个类群, 第Ⅰ 聚类组共有3个品种(系), 分别为‘ 阿坝’ 、‘ 川草2号’ 和‘ 雅江’ 老芒麦, 第Ⅱ 聚类组仅有‘ 康巴’ 老芒麦。结果说明, ‘ 阿坝’ 和‘ 川草2号’ 老芒麦亲缘关系接近, ‘ 康巴’ 老芒麦较其他3个品种(系)遗传背景可能更复杂。

图2 4个老芒麦品种(系)的SSR遗传多样性聚类图Fig.2 Dendrogram of cluster analysis of four Elymus sibiricus cultivars (strains) based on SSR markers

2.2.3 老芒麦品种(系)SSR标记指纹图谱 13对引物中的Elw0669s043、WMS169、Xgwm190及Xgwm311共4个引物可直接鉴定4个老芒麦品种(系), 其余引物只能鉴别其中的 1个或2个品种。基于这4对SSR引物构建供试老芒麦品种(系)的分子标记图谱(图3)。

图3 基于4对SSR引物扩增的供试老芒麦品种(系)指纹图谱
注: 1, 阿坝; 2, 川草2号; 3, 康巴; 4, 雅江。引物依次为WMS169、Elw0669s043、Xgwm190及Xgwm311。Fig. 3 SSR fingerprintings for Elymus sibiricus cultivars (strains), amplified by 4 primer pairs
Note:1, Aba; 2, Chuancao No.2; 3, Kangba; 4, Yajiang. Order of primers, WMS169, Elw0669s043, Xgwm190 and Xgwm311.

3 讨论

形态学标记与分子标记是植物育种过程中非常重要的手段, 形态学特征具有直观、简便、易测等优点, 但同时也易受光、温、水肥等环境条件或栽培条件的影响, 特别对于一些在形态学特征上差异较小的品种, 单纯依靠植物的形态学特征来鉴别品种存在很大的不确定性[26]。分子标记不受发育时期及环境条件的影响, 标记联合使用不仅有利于深入研究种质资源, 而且可为品种鉴定提供更加科学的理论依据[27]。

本研究利用23个形态学性状及13个SSR标记, 分析了4个老芒麦品种(系)表型性状的显著性及分子遗传的多样性。基于表型测定的结果表明, 品种间的不同形态性状差异显著, 其中, ‘ 雅江’ 老芒麦的6个形态性状均值显著高于其它3个品种, 表现出优良的农艺性状, ‘ 阿坝’ 老芒麦和‘ 川草2号’ 老芒麦形态差异不显著, 因此很难直接根据某几个性状区分所有品种(系)。分子标记能较好地弥补不足, 尽管SSR分子标记在种质鉴别应用中, 存在遗传距离越近、鉴别越有难度[28]的问题, 但是在本研究中利用的SSR引物, 不仅供试种质中均表现出较高的多态性(PPB=76.32%, PIC=0.309, H=0.451), 而且获得4对引物(Elw0669s043, WMS169, Xgwm190, Xgwm311), 可用于绘制DNA指纹图谱, 快速准确鉴定品种之间的差异, 这为今后的品种鉴定提供了理论基础。

同时, 对形态性状的欧氏距离和SSR分子遗传距离矩阵之间进行Mantel相关性分析, 一般定义当0.5< r< 0.8时, 两变量之间中度相关[29], 本研究结果(r=0.695 7, P=0.084 8)显示形态性状的欧氏距离和SSR分子遗传距离矩阵之间具有强的正相关性, 表明联合形态学标记和遗传标记能很好地用于品种鉴定。基于形态数据以及SSR分子标记的聚类结果基本一致且均显示‘ 阿坝’ 老芒麦和‘ 川草2号’ 老芒麦差异不显著, 亲缘关系接近, ‘ 康巴’ 老芒麦与其他3个品种的亲缘关系最远。出现这种结果的原因可能是野生牧草驯化品种群体多为混合选择或轮回选择而来, 其群体内杂合性可能要高于原始材料较纯合或单一的育成品种[30]。具体而言, ‘ 阿坝’ 老芒麦和‘ 川草2号’ 老芒麦品种均是以四川省红原、若尔盖、阿坝等县天然草地的野生老芒麦种群作为选育原始材料[31, 32], 其地理距离较小, 遗传背景差异可能不大; ‘ 康巴’ 老芒麦的遗传基础可能更复杂, 来自甘孜州高原农牧区多县的野生老芒麦种群[33], 来自多份材料的可能的混杂后代, 又进行混合选择选育出来, 而其他3个品种遗传基础相对单一, 即原始来源仅1~3份材料。另外, 老芒麦虽为自花授粉的繁育方式, 但存在较高异交率, 属于兼性自交[34, 35, 36], 故而采用开放授粉选育的品种群体内部具有一定的杂合性; 以及在品种繁育推广过程中机械或生物学混杂等[28]原因造成了品种之间的遗传分化较弱。

4 结论

采用形态学标记和分子标记对原始群体来自川西北高原的4个老芒麦品种(系)的结果表明, 各品种表型性状与遗传背景差异较明显, 并筛选出4个引物将供试品种鉴定出来, 绘制了DNA指纹图谱, 表明‘ 雅江’ 老芒麦新品系具有明显区别于其它3个主推品种的形态特征和遗传背景, 这为川西北高原老芒麦主要品种的遗传关系分析及品种的知识产权保护提供了支撑数据。

The authors have declared that no competing interests exist.

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