本研究于2016年4月至11月在西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室进行。选择3个葡萄风信子品种[‘ 亚美尼亚’ (M. armeniacum)、‘ 粉日出(M. armeniacum ‘ Pink Surprise’ )及‘ 白丽人’ (M. aucheri ‘ White Beauty’ )]为材料。根据开花的时间, 将葡萄风信子花分为5个不同发育时期(S₁~S₅), 具体参照焦淑珍等描述^[18]。2016年4月在试验田采集3个品种不同时期的花、根、鳞茎和叶, 液氮速冻后快速置于-80 ℃冰箱中备用。

1.2.1 葡萄风信子总RNA的提取与MaFLS1基因cDNA全长的克隆 分别从3个葡萄风信子品种的根、鳞茎、叶以及不同发育时期(S₁~S₅)的花蕾提取总RNA(Omega公司RNA试剂盒), 反转录合成cDNA第一链。

依据转录组测序获得的3GT注释序列, 设计特异引物3GT-F和3GT-R(表1), 以蓝色葡萄风信子‘ 亚美尼亚’ 各个组织cDNA混合样为模板进行全长PCR扩增。反应程序:94 ℃预变性3 min, 94 ℃变性30 s, 67 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min; 28个循环, 72 ℃延伸5 min。电泳检测后回收预期大小片段的条带, 连接pMD19-T载体, 转化大肠杆菌感受态细胞, 蓝白斑筛选后, 挑选阳性克隆送北京奥科生物科技有限公司测序^[19]。测序后拼接序列, 获得葡萄风信子的3GT基因cDNA全长序列。

图1

Fig. 1

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	图1 葡萄风信子‘ 亚美尼亚’ 类黄酮物质代谢示意图Fig. 1 The schematic diagram of flavonoid metabolic pathway in Muscari armeniacum

1.2.2 葡萄风信子Ma3GT基因生物信息学分析 用NCBI中的ORF Finder在线工具查找葡萄风信子Ma3GT基因开放阅读框; 用ExPASyProtParam在线预测Ma3GT氨基酸序列的组成成分及理化性质; 用NCBI Blastp搜索同源序列, 用ProtScale在线预测Ma3GT蛋白的亲水性/疏水性; 用TMpred在线分析Ma3GT蛋白的跨膜结构域; 用SignalP 4.1 Server分析Ma3GT蛋白信号肽; 用SOPMA在线分析Ma3GT蛋白二级结构。用DNAMAN完成同源序列比对; 用MEGA6.0软件完成系统进化树的构建^{[20, 21]}。

1.2.3 葡萄风信子Ma3GT基因的时空表达分析 为了研究Ma3GT在不同花色葡萄风信子的时空表达模式, 根据扩增获得的Ma3GT基因全长序列设计实时定量PCR引物3GT-qPCR-F和3GT-qPCR-R, 选取Actin为内参基因^[19](引物如表1所列)。以3个品种葡萄风信子根、茎、叶, 不同发育时期花(S₁~S₅)cDNA作为模板, 进行实时定量PCR。参照荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)说明书, 在BIO-RAD Cycler IQ₅荧光定量PCR仪上检测Ma3GT基因的相对表达量。反应体系(20 μL)为:SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL, PCR正反向引物(10 μmol· L^-1)各0.8 μL, cDNA模板1 μL(约100 ng), ddH₂O 7.4 μL, 反应程序:94 ℃ 3 min, 94 ℃ 15 s, 58 ℃ 30 s, 45个循环。数据读取由实时荧光定量PCR仪自动完成。每个样品3个生物学重复, 用SigmaPlot 10.0软件进行数据处理及图形绘制^[19]。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 葡萄风信子3GT基因克隆及表达分析所用的引物 Table 1 Primer sequences of 3GT gene used in cloning and Real-time quantitative PCR 引物名称Primers 引物序列(5'-3')Sequence(5'-3') 用途Purpose 3GT-F ATGGGCTCCGTCGACCACCCCCACGT cDNA amplification 3GT-R TCAACGGGCGGCGAGGATCATCTCCGTC cDNA amplification 3GT-qPCR-F GTTGGCATCCAAGGGAGAAG Real-time PCR 3GT-qPCR-R GGAGGAGCATCGCGAATTT Real-time PCR Actin-F[19] AACATTCAGAAAGAGTCCACCC Real-time PCR Actin-R[19] GCTTACCAGCAAAGATCAACCG Real-time PCR

表1 葡萄风信子3GT基因克隆及表达分析所用的引物 Table 1 Primer sequences of 3GT gene used in cloning and Real-time quantitative PCR

为了解糖基化过程中重要的编码酶基因3GT在葡萄风信子花色形成的作用, 在前期转录组测序的基础上, 本研究选择一条3GT注释序列展开研究。以此

条基因序列设计特异引物, 以蓝色葡萄风信子品种‘ 亚美尼亚’ 各组织cDNA混合样为模板PCR扩增基因全长, 获得一条长1 377 bp的条带(图2), 转化测序后序列拼接, 分析其为完整的开放阅读框, 具有起始密码子和终止密码子, 编码458个氨基酸, 是一条完整的基因序列(图3)。命名此cDNA序列为Ma3GT。

图2

Fig. 2

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	图2 Ma3GT cDNA全长扩增产物 注:M, DNA标准分子量; 1, Ma3GT cDNA全长扩增结果。Fig. 2 Full length of Ma3GT cDNA amplification Note:M, DNA marker; 1, The product of Ma3GT cDNA.

图3

Fig. 3

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	图3 Ma3GT基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列Fig. 3 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Ma3GT

在线工具ProtParam分析表明, Ma3GT理论分子量约为48.3 kD, 理论等电点为5.69, 蛋白不稳定系数为34.15, 属于稳定蛋白。利用ProtScale分析, Ma3GT编码的蛋白亲水性/疏水性的最大值为2.111, 最小值为-2.478, 且亲水性氨基酸残基比疏水性氨基酸残基多, 推测为亲水性蛋白(图4A)。TMHMM预测Ma3GT蛋白无跨膜区域(图4B)。SignalP4.1预测显示Ma3GT蛋白不具备信号肽位点(图4C)。SOPMA预测Ma3GT蛋白二级结构组成为38.21%的α 螺旋、12.45%的β 转角、33.19%无规则卷曲和16.16%延伸链(图4D)。

图4

Fig. 4

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图4 Ma3GT蛋白的生物信息学分析 注:Ⓐ, 亲水性/疏水性分析; Ⓑ, 氨基酸跨膜分析; Ⓒ, 信号肽位点分析; Ⓓ, 蛋白的二级结构预测; α 为α -螺旋; β 为β -转角; E为延伸链; R为无规则卷曲。Fig. 4 Bioinformatics analysis of Ma3GT protein Note:Ⓐ, Analysis of hydrophilic and hydrophobic amino acids; Ⓑ, Transmembrane analysis; Ⓒ, Signal peptide analysis; Ⓓ, Secondary structures prediction; α , indicates alpha helix; β , indicates beta turn; E, indicates extend strand; R, indicates random coil.

在NCBI上将葡萄风信子Ma3GT氨基酸序列进行Blastp比对, 分析表明, Ma3GT与油棕(Elaeisguineensis)、海枣(Phoenix dactylifera)3GT同源性最高, 可达63%~64%; 与小苍兰、荷兰鸢尾、中国水仙、洋葱(Allium cepa)、福士郁金香(Tulipafosteriana)、小果野芭蕉(Musa acuminata subsp. malaccensis)等其他物种的同源性较高, 达55%~61%, 而与拟南芥、金鱼草和矮牵牛等常见模式植物的同源性不高。

用DNAMAN软件将葡萄风信子Ma3GT与其他物种已发表的3GT进行同源序列比对(图5), 结果发现Ma3GT蛋白类似于其他3GT蛋白, C末端包含44个氨基酸的糖基转移酶的PSPG保守序列(从336个氨基酸到379个氨基酸), 该序列参与绑定蛋白到糖核苷酸的UDP糖基过程, 且其第22(Trp, W)、23(Asn, N)和44(Gln, Q)位氨基酸残基为葡糖基转移酶中的保守基序, 在酶蛋白糖基供体特异性中起到决定性作用。这表明Ma3GT属于葡糖基转移酶, 推测它与其他物种的3GT具有相同或相似的功能, 待进一步实验验证。

图5

Fig. 5

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图5 葡萄风信子Ma3GT基因编码的氨基酸序列与其他物种3GT氨基酸序列的比对 注:氨基酸序列相同及相似部分分别用黑、灰色阴影表示; 下划线位置为PSPG保守序列。黑星号为PSPG保守序列的第22、23和44个氨基酸。Fh3GT(小苍兰Freesia hybrid HM590645), Ih3GT(荷兰鸢尾Iris hollandica AB161175), Zm3GT(玉米Zea mays AY167672), Hv3GT(大麦Hordeum vulgare X15694), At3GT(拟南芥Arabidopsis thaliana AED92377), Ph3GT(矮牵牛Petunia hybrida AB027454)。Fig. 5 Alignment of the deduced amino acid sequences of Ma3GT of grape hyacinth and other plants

Note:The same and similar amino acid residues are highlighted in black and gray, respectively. Underline indicates the PSPGbox found in glycosyltransferases.

用MEGA6.0将葡萄风信子Ma3GT氨基酸与其他物种GT氨基酸(包括3GT、5GT等)构建系统进化树, 结果显示, Ma3GT氨基酸序列首先与小苍兰、荷兰鸢尾的3GT聚为一支, 再与玉米、大麦3GT聚为一类, 而后与其他双子叶植物3GT聚为一大类, 而与其他类葡糖基转移酶, 如5GT的亲缘关系较远(图6)。据此结果, 再次说明Ma3GT属于3GT成员, 且属于单子叶植物亚类, 与单子叶观赏植物小苍兰和荷兰鸢尾3GT亲缘关系最近。

图6

Fig. 6

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	图6 Ma3GT蛋白与其他物种的GT蛋白的系统进化树Fig. 6 Phylogenetic tree of Ma3GT proteins and other GT proteins from other species

以葡萄风信子根、茎、叶及盛花期(S₄)花的cDNA为模板, 利用荧光定量PCR检测Ma3GT基因在葡萄风信子不同组织中的表达情况。结果显示, Ma3GT在蓝色葡萄风信子‘ 亚美尼亚’ 花(S₄)中高表达, 在叶片中微量表达, 而根和鳞茎中几乎不表达(图7)。说明Ma3GT基因在蓝色葡萄风信子‘ 亚美尼亚’ 中为花特异表达的模式。此外, Ma3GT基因在白色葡萄风信子‘ 白丽人’ 及粉色葡萄风信子‘ 粉日出’ 各个组织中几乎不表达。

图7

Fig. 7

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	图7 Ma3GT在‘ 亚美尼亚’ 不同组织部位的表达分析 注:不同小写字母表示差异显著(P≤ 0.05)。下图同。Fig. 7 Expression patterns of Ma3GT in the different organs of Muscari armeniacumNote:Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level; similarly for the Fig. 8.

以蓝、白和粉色3个葡萄风信子品种5个不同时期花cDNA为模板, 荧光定量PCR检测Ma3GT在不同花色葡萄风信子不同花发育时期的表达情况。结果显示(图8), 在‘ 亚美尼亚’ 花中, Ma3GT在未着色的小花蕾时期(S₁)几乎不表达, S₂时期开始着色后Ma3GT表达量逐步迅速增加, 到了完全着色的盛花期(S₄), Ma3GT的表达量到达顶峰, S₅时期花开始衰败后又有所下降。不同于‘ 亚美尼亚’ , Ma3GT在‘ 白丽人’ 和‘ 粉日出’ 所有花发育时期几乎不表达。在测定葡萄风信子花青素苷物质时还发现, 蓝色葡萄风信子‘ 亚美尼亚’ 不同时期的花蕾中均检测到大量的飞燕草素3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素3-O-葡萄糖苷及天竺葵素3-O-葡萄糖苷及其他类花青素苷衍生物, 而‘ 白丽人’ 花中并未检测到花青素3-O-葡萄糖苷物质存在。推测, Ma3GT基因表达与葡萄风信子花青苷物质, 尤其是花青素3-O-葡萄糖苷的累积有密切的关系。

图8

Fig. 8

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	图8 Ma3GT在3个葡萄风信子品种5个花发育时期的表达分析 注:S1为未着色的花蕾; S2为开始着色的花蕾; S3为完全着色未开放的花蕾; S4为完全开放的花蕾; S5为衰败的花蕾。Fig. 8 Expression patterns of Ma3GT in five different stages of three different cultivars of grape hyacinth Note:S1, Unpigmented flower bud; S2, Flower bud being Pigmented; S3, Pigmented flower bud just before bloom; S4, Fully-opened flower bud; S5, Declined flower bud.