引用本文
荆佩欣, 张红梅, 曹蕾, 许冬梅, 张永辉, 郭旭生. 青藏高原耐低温乳酸菌在垂穗披碱草青贮中的应用. 草业科学, 2017,34(11):2396-2402
Jing Pei-xin, Zhang Hong-mei, Cao Lei, Xu Dong-mei, Zhang Yong-hui, Guo Xu-sheng. Application of lactic acid bacteria to Elymus nutans silage from the Tibetan Plateau . Pratacultural Science,2017,34(11): 2396-2402  
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Copyright©2017, 《草业科学》编辑部
青藏高原耐低温乳酸菌在垂穗披碱草青贮中的应用
荆佩欣1, 张红梅2, 曹蕾3, 许冬梅1, 张永辉3, 郭旭生1
1.草地农业生态系统国家重点实验室,兰州大学生命科学学院,甘肃 兰州 730000
2.草地农业生态系统国家重点实验室,兰州大学草地农业科学技术学院,甘肃 兰州 730020
3.甘肃省草原技术推广总站,甘肃 兰州 730046
郭旭生(1978-),男,宁夏海原人,教授,博士,主要从事饲料青贮技术与营养价值评价研究。E-mail:[email protected]

第一作者:荆佩欣(1992-),女,山西运城人,在读硕士生,主要从事饲料青贮技术与营养价值评价研究。E-mail:[email protected]共同第一作者:张红梅(1990-),女,甘肃古浪人,硕士,研究方向为饲草加工及青藏高原乳酸菌发酵性能研究。E-mail:[email protected]

收稿日期: 2017-03-24
基金项目: 基金项目:国家自然科学基金(31272486)
摘要

为探讨一株低温发酵戊糖片球菌Q6在不同温度条件下对垂穗披碱草( Elymus nutans)青贮饲料发酵品质的影响。本研究设置了对照组(清水,CK)、耐低温戊糖片球菌Q6及商品化的戊糖片球菌(APP)3个处理,分别在10、15、25 ℃温度下进行垂穗披碱草青贮,在青贮发酵30、60、90 d后取样测定其发酵品质和化学成分。结果表明,添加耐低温戊糖片球菌Q6在15 ℃下青贮60 d时,青贮饲料发酵品质明显优于CK组和APP处理组,有效降低了青贮料的pH,增加了乳酸含量,并保存更多的干物质。同时,添加菌株Q6不仅提高了青贮饲料中乳酸菌数量而且抑制了酵母和霉菌生长。因此,戊糖片球菌Q6是一株适宜于青藏高原牧草低温青贮的优良乳酸菌。

关键词: 青藏高原; 戊糖片球菌; 垂穗披碱草; 低温青贮; 青贮品质
中图分类号:S816.5+1 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2017)11-2396-07 doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0614
Application of lactic acid bacteria to Elymus nutans silage from the Tibetan Plateau
Jing Pei-xin1, Zhang Hong-mei2, Cao Lei3, Xu Dong-mei1, Zhang Yong-hui3, Guo Xu-sheng1
1.State Key Laboratory of Grassland and Agro-Ecosystems, School of Life Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
2.State Key Laboratory of Grassland and Agro-Ecosystems, School of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, Gansu, China
3.Gansu Provincial Extension Station of Grassland Techniques, Lanzhou 730046, Gansu, China
Corresponding author: Guo Xu-sheng E-mail:[email protected]
Abstract

The study was conducted to investigate the effect of applying a low temperature fermentative strain of Pediococcus pentosaceus Q6 on the fermentation quality of Elymus nutans silage ensiled at different temperatures. Before ensiling of E. nutans, the grasses were treated without inoculation or with inoculation of either the strain of Pediococcus pentosaceus Q6 or a commercial strain P. pentosaceus (APP). The treated grasses were then ensiled at 10, 15 and 25 ℃, respectively. The ensiled grasses were opened on 30, 60 and 90 d after fermentation for laboratory analysis. The results showed that after 60 days of fermentation at 15 ℃, the fermentation quality of the silage inoculated by P. pentosaceus Q6 was obviously better than the control silage or silage inoculated by APP. Inoculation of P. pentosaceus Q6 at ensiling had an effective reduction in silage pH, and also increased the concentration of lactic acid dry matter in ensiled grasses compared to the control silage or silage inoculated by APP. Meanwhile, application of P. pentosaceus Q6 not only increased the count of lactic acid bacteria, but also inhibited the growth of yeasts and molds in the grass silage. Therefore, P. pentosaceus Q6 is a candidate strain that can be used to making silage at low temperature in the Tibetan plateau.

Keyword: Qinghai-Tibet plateau; Pediococcus pentosaceus; Elymus nutans; low temperature ensiling; fermentation quality

随着畜牧业的发展, 健康有机的畜产品已经成为当今畜牧业的发展导向, 而健康优质的饲草则是有机畜牧业的基础。在青贮饲料制作中添加乳酸菌, 既有利于牧草的贮藏, 又能使青贮饲料保持更多营养物质, 同时依托乳酸菌这种益生菌可生产出生态、绿色的青贮饲料。

近年来, 国内外有关乳酸菌在青贮饲料生产中的应用备受关注。在青贮玉米(Zea mays)中添加乳酸菌可以缩短青贮时间, 利于青贮玉米营养品质的提高[1-2]; 在青稞(Hordeum vulgare)秸秆、多年生黑麦草(Lolium perenne)、紫花苜蓿(Medicago sativa)中添加乳酸菌可以促进乳酸菌早期发酵, 使pH下降加快, 保留更多粗蛋白, 减少干物质损失、酵母菌和霉菌数量[3, 4]; 家畜采食添加乳酸菌的青贮饲料后, 产奶量显著增高[5]。可见, 青贮饲料中添加乳酸菌可以显著提高青贮饲料品质。

在自然青贮过程中, 环境温度是影响乳酸菌活性的重要因素[6]。冬季的低温条件会限制全混合日粮(TMR)的乳酸发酵[7]。青藏高原牧草收获季平均气温只有15~20 ℃, 使原料自身携带的不多的乳酸菌代谢繁殖会受到低温的抑制, 难以调制出高品质的青贮饲料。而传统乳酸菌商品添加剂中乳酸菌适宜生长温度为20~37 ℃, 不能很好地适应当地低温气候, 易造成青贮饲料发酵不完全, 青贮效果差, 很难发挥有效作用。在20 ℃条件下, 商品乳酸菌的生长活性会受到影响, 不能很好地发挥作用[8]。若在青贮中添加耐低温乳酸菌, 不仅可以增加青贮乳酸菌数量, 还可以代谢产酸, 提前实现较低的 pH 环境, 从而更好地抑制腐败菌的活动, 提高青贮品质。目前, 国内关于青藏高原耐低温乳酸菌的研究很少, 秦丽萍[9]发现, 从青藏高原垂穗披碱草分离筛选得到的乳酸菌在15 ℃下可明显提高垂穗披碱草(Elymus nutans)青贮品质。因此, 本研究将筛选的青藏高原耐低温乳酸菌添加至垂穗披碱草, 分别在10、15、25 ℃下进行青贮, 并分析其发酵品质和化学成分, 旨为青藏高原乳酸菌添加青贮饲料提供理论依据和有效乳酸菌菌剂。

1 材料与方法
1.1 试验材料

以2015年7月31日采集的甘肃省武威市天祝县抓喜秀龙乡天然草地(海拔2 965 m)抽穗期的垂穗披碱草为青贮原料, 用饲草加工与利用实验室所选1株优良耐低温乳酸菌— — 戊糖片球菌(Q6)和商品化的戊糖片球菌(American commercial inoculants Pediococcus pentosaceus, APP)共两株乳酸菌为青贮添加剂。

1.2 试验设计

青贮试验采用菌种× 青贮温度的双因素设计。其中, 菌种分别为蒸馏水(对照, CK)、Q6和APP, 青贮温度设10、15和25 ℃, 每个处理3次重复。

1.3 测定指标和方法

1.3.1 乳酸菌添加青贮 将垂穗披碱草萎蔫至水分含量为65%~70%时, 剪成2~3 cm的片段, 将活化好的待添加乳酸菌按照1× 106 cfu· g-1的数量比均匀喷洒到草样中, 对照组用等量蒸馏水代替。混匀后用聚氯乙烯塑料袋(30 cm× 23 cm)装200 g左右草样, 真空包装机抽真空并封口后分别在10、15和25 ℃培养箱中培养30、60和90 d后取样。

1.3.2 发酵品质测定 称取20 g青贮原样和垂穗披碱草青贮30、60和90 d后的样品, 同时量取180 mL蒸馏水按草水重量1∶ 9的比例, 高速搅拌30 s后用4层纱布过滤制备浸提液, 于-20 ℃保存部分浸提液用于pH、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate, WSC)和氨态氮(ammonia nitrogen, AN)的测定; 同时用50%硫酸溶液酸化剩余浸提液使其pH降低至2.0后于-20 ℃保存, 用于乳酸(lactic acid, LA)、乙酸(acetic acid, AA)、丙酸(propionic acid, PA)、丁酸(butyric acid, BA)的测定。用 pH计测定青贮料浸出液的pH, 可溶性碳水化合物(WSC)用蒽铜-硫酸比色法测定; 氨态氮(AN)含量用苯酚-次氯酸钠比色法测定[10]; 乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)、丁酸(BA)用高效液相色谱法测定[11]; 干物质(dry matter, DM)含量在105 ℃烘干测定[12]。

1.3.3 微生物计数 在超净工作台取青贮30、60和90 d的样品或原样5 g于含有45 mL灭菌生理盐水的螺口瓶中封口, 摇床180 r· min-1室温振荡60 min后取上清作为细菌悬浮液, 用灭菌生理盐水按照10-1至10-5的稀释梯度稀释悬浮液, 选取适当浓度涂布MRS(培养乳酸菌lactic acid bacteria, LAB)和PDA(培养酵母菌yeast和霉菌molds)平板培养基, MRS平板37 ℃厌氧培养48 h后计数, PDA平板37 ℃有氧培养后计数。

1.3.4 化学成分测定 取适量90 d青贮时的垂穗披碱草样品或原样, 于65 ℃鼓风干燥48 h烘干, 微型粉碎机粉碎后过1 mm筛后备用。粗蛋白(crude protein, CP)采用凯氏定氮法测定, 中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)含量用范氏洗涤法测定[10]。

1.4 数据分析

用EXCEL进行基础数据整理和图表制作, 用SPSS 15.0的一般线性模型的双因素分析进行处理效应的差异显著性分析, 并对不同菌处理之间进行Duncan多重比较分析。

2 结果与分析
2.1 天祝垂穗披碱草原样营养成分和微生物数量

青贮进行前, 取样测定垂穗披碱草原样中的营养成分, 经测定, 垂穗披碱草原样的pH为6.52, 干物质含量占鲜样的28.56%, 粗蛋白、可溶性糖、NDF和ADF含量分别占干物质含量的5.50%、15.90%、61.90%和31.50%。青贮前的微生物数量, 乳酸菌为4.14 lg(cfu· g-1), 酵母菌3.93 lg(cfu· g-1), 霉菌为3.15 lg(cfu· g-1)。

2.2 垂穗披碱草青贮样品的发酵品质和化学成分

垂穗披碱草青贮30 d后, 对照组在3个青贮温度下的样品浸提液pH都较高, 均在6.0以上, 显著高于Q6处理组和APP处理组(P< 0.05), 在10 ℃时, pH为6.42, 与原样pH差别不大, 可溶性糖含量也显著高于其他处理, 而乳酸含量著低于大部分处理; 25 ℃时, 青贮样品中酵母菌数量显著高于同温度其他处理组(表1)。Q6处理组在10 ℃时, 乳酸含量为2.76%, 显著高于对照组, 干物质含量也显著高于APP处理组; 15 ℃时, 干物质含量较高, pH最低, 为5.15, 乳酸菌数目也最多, 可溶性糖含量较低, 乳酸含量和乙酸含量与部分处理无显著差异(P> 0.05); 25 ℃时, pH显著低于对照组, 其可溶性糖、乳酸含量(除CK外)与其他处理组差异不显著。APP处理组的干物质含量在3个青贮温度下均低于Q6处理组, 可溶性糖含量, 乳酸含量及乙酸含量与Q6处理组间无显著差异。总的来看, Q6处理组在15 ℃时的低温发酵效果要好于其他处理组。

表1 添加戊糖片球菌垂穗披碱草青贮30 d发酵品质和微生物数量 Table 1 Fermentation characteristics and microbial populations of Elymus nutans silages treated with Pediococcus pentosaceus after 30 days of ensilage

注:CK为对照, Q6和APP为戊糖片球菌; NS, * * , * * * , 分别表示P> 0.05, P< 0.01, P< 0.001; 同列不同小写字母表示所有处理间差异显著(P< 0.05)。下同。

Note:CK, control; Q6, Pediococcus pentosaceus Q6; APP, Pediococcus pentosaceus APP; NS, P> 0.05; * * , P< 0.01; * * * , P< 0.001; Different lowercase letters within the same column indicate significant difference among all treatments at the 0.05 level. similarly for the following tables.

青贮60 d 后, 对照组样品的pH在3个青贮温度下仍显著高于其他两个处理组(P< 0.05), 可溶性糖含量也高于其他处理组, 乳酸含量低于Q6处理组, 与APP处理组差异不显著(P> 0.05)(表2)。比较可知, 青贮60 d样品的乳酸菌数量低于青贮30 d样品, 但仍高于青贮原样。随青贮天数的延长, 对照组样品中附着酵母菌数量无显著变化, 但添加戊糖片球菌的Q6处理组和APP处理组的酵母菌在25 ℃条件下未检测出。Q6处理组在15 ℃条件下, 干物质含量显著高于同温度其他处理组; pH显著低于同温度其他处理; 可溶性糖含量与APP处理组差异不显著; 有机酸含量高于其他两个处理组, 且其青贮效果优于25 ℃条件下青贮效果。说明所选戊糖片球菌Q6具低温发酵优势。

青贮90 d后, 对照组的粗蛋白含量显著高于Q6处理组和APP处理组(P< 0.05)(表3、表4)。青贮90 d后, Q6处理组样品浸提液的pH与60 d时的相差很小; 酵母菌和霉菌基本没有检测到。Q6处理组在15 ℃下的青贮样品, pH低于对照组, 高于APP处理组(P> 0.05), 可溶性糖较高, 干物质含量显著低于其他处理组; 在25 ℃下, pH显著低于对照组, 乳酸、乙酸含量都显著低于APP处理组, 乳酸菌数量也显著低于APP处理组。

表2 添加戊糖片球菌垂穗披碱草青贮60 d发酵品质和微生物数量 Table 2 Fermentation characteristics and microbial populations of Elymus nutans silages treated with Pediococcus pentosaceus after 60 days of ensilage
表3 添加戊糖片球菌垂穗披碱草青贮90 d化学成分 Table 3 Chemical composition of Elymus nutans silages treated with Pediococcus pentosaceus after 90 days of ensilage
表4 添加戊糖片球菌垂穗披碱草青贮90 d发酵品质 Table 4 Fermentation characteristics and microbial populations of Elymus nutans silages treated with Pediococcus pentosaceus after 90 days of ensilage
3 讨论

大量研究发现, 青贮饲料中添加乳酸菌可有效提高青贮饲料品质。乳酸菌厌氧发酵产生乳酸, 使青贮体系pH迅速降低, 抑制有害微生物的生长, 减少饲料营养物质的损失, 使青贮饲料保存更多的干物质和粗蛋白等。研究表明, 青贮时添加乳酸菌和纤维素酶可有效提高苜蓿青贮品质和营养成分[13]。作为良好青贮原料的全株玉米, 在青贮完成开窖后, 易发生二次发酵, 使青贮饲料霉变。添加乳酸菌可有效抑制有氧损坏, 提高青贮饲料的有氧稳定性, 在一定程度上抑制青贮饲料的变质, 减少经济损失。将来自藏北嵩草(Kobresia littledalei)的乳酸菌筛选后添加至苜蓿进行青贮, 发现添加肠膜明串珠菌后, 青贮苜蓿乳酸含量显著升高, pH显著降低, 且保存更多粗蛋白[14]。从青藏高原垂穗披碱草分离得到的植物乳杆菌、戊糖片球菌及清酒乳杆菌在15 ℃下可明显提高垂穗披碱草青贮品质[9]。本研究将筛选所得优良乳酸菌添加至垂穗披碱草进行青贮后也发现, 在低温10和15 ℃下, 所选的耐低温戊糖片球菌Q6处理组的青贮品质都显著高于对照组; 尤其是15 ℃, 青贮60 d的青贮品质显著优于对照组和APP处理组。

青贮饲料中, pH的快速降低能够抑制蛋白酶的活性, 减小蛋白质的降解损失, 并抑制不利于青贮发酵的厌氧微生物(如肠细菌和梭菌)的生长, 因此, pH 是决定青贮饲料质量的一个重要指标[15, 16, 17]。本研究中, Q6处理组青贮30和60 d样品的pH显著低于对照组及APP处理组, 但青贮90 d时, 15 ℃下样品的pH与对照及APP处理组差异不显著, 说明将戊糖片球菌Q6添加至垂穗披碱草青贮饲料中并在低温条件下发酵, 确实可以提高其青贮品质, 但青贮60 d以后, 可能由于Q6处理组可发酵底物不足, 同时青贮体系的pH已降到一个相对较低的水平, 已不利于乳酸菌继续发酵, 导致无显著差异, 但具体的原因, 有待进一步试验证明。

同时, 有机酸含量及其构成可以反映青贮饲料品质的优劣[18], 其中最重要的有乳酸、乙酸和丁酸。乙酸生成的途径有两个, 一是异型乳酸菌发酵在产生一分子乳酸的同时产生一分子乙酸, 二是由乳酸异化产生。当梭状芽胞杆菌和霉菌较活跃, 不仅消耗营养物质, 还产生大量丁酸, 而丁酸的酸臭味, 在很大程度上影响了青贮饲料的适口性, 使其品质变差, 本研究中所有处理组均未检测到丁酸, 说明发酵品质较好。乳酸由乳酸菌发酵底物产生, 可以迅速降低青贮饲料pH。本研究中, 低温条件下青贮30和60 d乳酸菌处理组的乳酸含量都明显高于对照组, 说明乳酸菌添加对提高青贮饲料品质具有显著作用。

乳酸菌作为添加剂, 可保证青贮饲料体系中乳酸菌的数量, 使乳酸菌成为青贮体系中的优势菌群, 迅速发酵产生乳酸, 迅速降低青贮体系pH, 抑制有害微生物的生长, 提高青贮品质。在进行水稻(Oryza sativa)秸秆青贮时, 在任何青贮阶段, 添加乳酸菌添加剂的处理组的青贮体系中乳酸菌的数量都高于对照组, 且酵母菌数量要比对照组少[19]。玉米刈割后存放时间越长, 其附着的有害杂菌数量越多, 青贮样品的pH越高, 即青贮体系中有机酸含量越少, 越不利于青贮, 而添加乳酸菌青贮添加剂后, 青贮饲料中的酵母菌和霉菌的生长被抑制, 青贮玉米的有氧稳定性被提高[20]。添加乳酸菌可使青饲料发酵过程中乳酸菌急剧增殖, 明显抑制霉菌、酵母菌以及一般细菌的增殖, 促进旺盛的乳酸发酵, 提高了乳酸含量, 提高了L(+)乳酸的生成比率7%~14%, 可使青贮饲料的pH迅速下降, 抑制丁酸菌的繁殖。此外, 由于所加入的乳酸菌产生抗菌物质和过氧化物, 也使不良微生物的生长繁殖受到抑制或死亡[21]。本研究表明, 在垂穗披碱草中添加青藏高原耐低温乳酸菌, 在青贮30 d时, 杂菌生长即被抑制, 且随青贮时间延长, 这种效果越明显。

4 结论

在垂穗披碱草青贮中添加青藏高原耐低温乳酸菌Q6, 在10和15 ℃低温下青贮后可显著提高牧草青贮品质; 而在25 ℃时青贮, 所选耐低温乳酸菌的发酵优势不显著。添加青藏高原耐低温戊糖片球菌Q6可有效降低青贮饲料pH, 增加乳酸含量, 保存更多的干物质, 且可以提高青贮体系中乳酸菌数量, 抑制酵母和霉菌生长。戊糖片球菌Q6是一株较适于低温青贮的优良乳酸菌。

The authors have declared that no competing interests exist.

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