试验采样地位于青藏高原东缘的甘肃省甘南玛曲草原站, 海拔为3 500 m左右。该区域属于高寒湿润气候, 年均温为1.2 ℃左右, 月均最低(1月) 和最高(7月)平均气温分别为-10 ℃和11.7 ℃, 年降水量约为620 mm。主体土壤类型为亚高山草甸土, 植被类型是禾本科的垂穗披碱草(Elymus nutans)、老芒麦、早熟禾、匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera)、羊茅(Festuca ovina); 莎草科的线叶嵩草(Kobresia capillifolia)为优势种。小花草玉梅(Anemone rivularis)、珠芽蓼(Polygonum viviparum)、草原老鹳草(Geranium pratense)、莓叶委陵菜(Potentilla fragarioides)、丝叶毛茛(Ranunculus tanguticus)等为常见种。同时伴有其他杂草的典型高寒草甸草原。试验站优势植物种群除莎草科线叶嵩草不能和AM真菌形成共生体外, 其他建群种禾本科植物均可以和AM真菌形成共生体。

1.2.1 供试土壤 将从玛曲放牧地所采集回来的土壤, 挑拣其他杂物并混合均匀后过筛, 筛子孔径为0.25 mm。土壤速效磷含量为5.16 mg· kg^-1。

1.2.2 供试植物 供试植物为老芒麦(Elymus sibiricus), 种子从玛曲放牧地所采集。挑选大小一致且籽粒饱满的种子, 先用75%的酒精消毒3 min, 再用3%的次氯酸钠对种子进行表面消毒10 min, 用自来水和蒸馏水冲洗3次后, 均匀地摆放在装有湿润、无菌滤纸的培养皿内, 每皿25粒, 培养皿直径为9 cm, 置于黑暗条件下培养24 h后, 移至25 ℃光照培养箱中催芽48 h。

1.2.3 供试AM菌种 供试AM菌剂为根内球囊霉(Rhizophagus intraradices)和幼套球囊霉(Claroideoglomus etunicatum)混合菌剂, 购买于北京市农林科学研究院植物营养与资源研究所, 中国丛枝菌根真菌菌种资源保藏中心, 经三叶草(Trifolium pratense)扩繁所得。

1.3.1 放牧地设置 玛曲放牧地分为轻度放牧(LG)、中度放牧(MG)和重度放牧(HG)3个放牧强度。轻度放牧为每轮牧小区8只羊, 共6个轮牧小区, 周期45 d; 中度放牧为每轮牧小区16只羊, 共6个轮牧小区, 周期45 d; 重度放牧为每轮牧小区8只羊, 放牧期间持续放牧, 不轮牧。暖季6-9月为放牧季节, 放牧期7-14 d(根据气候和牧草生长阶段适度调整)。每个轮牧小区选取若干植被盖度和群落相对一致的地点, 按照对角线取样法, 挖取5-15 cm土层土壤装入自封袋, 每个点3 kg左右。每个放牧强度采集约50 kg左右土样, 带回兰州进行温室试验。

1.3.2 丛枝菌根真菌处理设置 温室试验于2014年7月到2014年10月在兰州大学草地农业科技学院榆中智能温室中进行, 对各放牧处理过筛后的土壤进行以下4种处理:

自然土(NS):试验地土壤不经过任何处理, 保留原有的AM真菌及其他微生物区系;

灭菌土(SS):采用高温湿热灭菌法, 于121 ℃高压灭菌两次, 每次灭菌1 h, 两次灭菌间隔24 h;

灭菌后还原除AM真菌外微生物土(NM):土壤灭菌后(方法同上), 还原上述灭菌土壤中除AM真菌以外的其他微生物。将100 g自然土用200 mL无菌水稀释, 用两层42号滤纸过滤两次, 过滤掉AM真菌孢子, 滤液中除AM真菌以外的其他微生物, 将该滤液按10 mL· kg^-1的比例加入无菌土, 即可得到不含AM真菌的土壤。

接种AM真菌土(AM):土壤灭菌后(方法同上), 装入灭菌土至花盆3/5处, 各称取15 g扩繁的幼套球囊霉和根内球囊霉混合菌剂平铺在上面, 然后再覆盖一层无菌土至4/5处。

1.3.3 试验管理 将以上处理好的土壤, 按照每盆700 g, 装入花盆, 按土壤干重的10%浇水。在装有上述各处理土壤的花盆中, 移栽催芽的老芒麦幼苗, 每盆移栽5株, 出苗一周后, 选择生长较为一致的保留3株, 生长期间根据水分损失情况, 补充至土壤重量的10%。生长期间每周测定一次株高和分蘖。植物在生长7周后, 自然发生白粉病, 发病两周后收获, 收获前测定白粉病发病率、光合指标, 收获时采集不同处理植株相同部位的新鲜叶片, 用于测定生理生化指标。

试验包括轻度、中度和重度3个放牧强度, 各放牧强度包括自然土、灭菌土、无AM真菌土和接种AM真菌土4个土壤处理, 每个处理4个重复。

1.4.1 老芒麦白粉病发病率调查 每盆随机选取20个叶片, 记录发病叶片数。

每盆发病率=发病叶片数/20× 100%。

每个处理4个重复, 各处理下老芒麦白粉病的发病率为4个重复的平均值。

1.4.2 菌根侵染率的测定

染色镜检法测定菌根侵染率^[24]:将收获的老芒麦根系冲洗干净后称取0.2 g左右, 置于10% KOH溶液中30 min, 然后于60 ℃水浴中加热1 h, 倾去KOH溶液, 将根系置于1 mol· L^-1 HCl溶液中酸化30 s, 倾去HCl; 用蒸馏水冲洗3次后, 用解剖镜检查植物根部皮层中的有色物质是否已除去, 若色素已基本去除, 则用0.05% Trypan Blue染色, 并置于60 ℃水浴保持5~10 min, 冷却后用十字交叉法计算菌根侵染率^[25]。

1.4.3 老芒麦总生物量

总生物量:地上、地下部分均先称取鲜重(W₁), 然后采用烘干法测定, 先在105 ℃杀青20 min, 然后于80 ℃烘箱烘48 h, 称重(W₂)。地上、地下生物量根据测定可溶性糖、AM真菌侵染率等相关指标的鲜重(W₃)与干重比, 计算获得。

生物量= W2W1× W₃+W₂;

总生物量=地上生物量+地下生物量。

1.4.4 老芒麦磷含量测定

植物地上地下全磷:采用钼锑抗吸光光度法, 建立标准曲线, 用分光光度计(Pectrum, Shanghai 721, 中国), 于700 nm处测定吸光度值^[26]。由地上地下全磷含量计算得出总磷含量。

1.4.5 老芒麦叶绿素含量和光合速率

叶绿素含量:采用丙酮浸提法^[27]测定, 称取0.1 g新鲜植物叶片, 加丙酮处理获得提取液, 用分光光度计在波长665、645和652 nm下测定吸光度值。

光合速率:早晨09:00-11:00用LI-6400便携式光合测定仪测定植株光合速率。测量时选择生长部位和生长状况一致的叶片进行测定, 每次测定5个重复。

1.4.6 老芒麦防御酶活性

多酚氧化酶(PPO)测定采用分光光度法^[27], 于398 nm 波长下测定吸光度。

试验数据录入Microsoft Excel 2007进行整理并计算、作图。用SPSS 19.0统计软件对数据进行显著性检验:分析过程中首先要对数据进行Levenes方差齐性检验, 若方差齐性(P> 0.05), 则可进一步分析。若方差不齐(P< 0.05)则先转换数据, 再进行显著性检验。

所有放牧强度和土壤处理下, 老芒麦均发生了不同程度的白粉病。与轻度放牧相比, 中度和重度放牧白粉病发病率分别降低了19.02%和25.03%(图1)。

图1

Fig. 1

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	图1 不同放牧强度处理下老芒麦白粉病发病率 注:不同小写字母表示不同处理间差异显著(P< 0.05)。下同。Fig. 1 Powdery mildew incidence in Elymus sibiricus under different grazing intensities Note:Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments at the 0.05 level. similarly for the following figures.

各土壤处理, 以自然土处理的老芒麦白粉病发病率最高。与自然土处理相比, 灭菌土、无AM真菌和接种AM真菌处理的老芒麦白粉病发病率分别降低了25.24%、19.75%和13.15%。放牧强度和土壤处理对老芒麦白粉病发病率存在交互效应(P< 0.05), 其中, 以重度放牧的灭菌土处理老芒麦白粉病发病率最低, 为39.84%。

灭菌土和无AM真菌处理的老芒麦根系未检测到菌根结构。自然土及接种AM真菌的处理老芒麦根系均形成了菌根结构, 且AM真菌侵染率因放牧强度和土壤处理而异(表1)。自然土处理下, 与轻度放牧相比, 中度和重度放牧的老芒麦AM真菌侵染率分别提高了23.93%和39.49%; 接种AM真菌处理下, 与轻度放牧相比, 中度和重度放牧的AM真菌侵染率分别提高了19.57%和48.32%(表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同放牧强度处理下老芒麦AM真菌侵染率 Table 1 AM colonization of Elymus sibiricus under different grazing intensities 处理 Treatment 自然土 Natural soil 接种AM真菌土 Inoculated AM fungi soil 轻度放牧 Light grazing 26.16± 0.10b 26.16± 0.10b 中度放牧 Moderate grazing 32.42± 0.06ab 31.28± 0.09b 重度放牧 Heavy grazing 36.49± 0.04a 38.80± 0.06a

表1 不同放牧强度处理下老芒麦AM真菌侵染率 Table 1 AM colonization of Elymus sibiricus under different grazing intensities

注:同列不同字母表示不同放牧强度间差异显著(P< 0.05)。

Note:Different lowercase letters within the same column indicate significant difference among the grazing treatments at the 0.05 level.

放牧可显著影响老芒麦总生物量。与轻度放牧相比, 重度放牧提高了23.46%(图2), 中度放牧下虽有提高, 但差异不显著(P> 0.05)。土壤处理以自然土处理的老芒麦总生物量最低, 显著低于其他处理(P< 0.05)。与自然土处理相比, 无菌土、无AM真菌土和接种AM真菌土处理的老芒麦总生物量分别提高了67.21%、62.89%和56.46%。放牧强度和土壤处理对老芒麦地下生物量不存在交互效应(P> 0.05)。

放牧、土壤处理对老芒麦地上地下总磷含量的影响与对总生物量的影响较为一致。与轻度放牧相比, 中度和重度放牧分别显著提高了34.02%和33.07%。土壤处理以自然土处理的老芒麦总磷含量最低, 显著低于其他处理(P< 0.05), 与自然土处理相比, 灭菌土、无AM真菌和接种AM真菌处理的老芒麦总磷含量分别提高了186.34%、176.22%和193.09%。不同放牧强度和土壤处理对老芒麦总P含量存在交互效应(P< 0.05)。自然土处理下各放牧强度的老芒麦总磷含量显著低于其它土壤处理, 与自然土处理相比, 灭菌土处理下轻度、中度和重度放牧分别提高了200.85%、285.11%和122.22%; 无AM真菌处理下轻度、中度和重度放牧分别提高了198.1%、285.1%和102.27%; 接种AM真菌处理下轻度、中度和重度放牧分别提高了179.7%、350.42%和111.83%(图3)。

图2

Fig. 2

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	图2 不同放牧强度处理下老芒麦总生物量Fig. 2 Total dry weights of Elymus sibiricus under different grazing intensities

图3

Fig. 3

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	图3 不同放牧强度处理下老芒麦总磷含量Fig. 3 Total P of Elymus sibiricus under different grazing intensities

放牧强度未显著影响老芒麦叶绿素含量(P> 0.05), 与轻度放牧相比, 中度放牧和重度放牧虽提高了老芒麦叶绿素含量, 但差异不显著。土壤处理以自然土处理的老芒麦叶绿素含量最低, 与自然土处理相比, 灭菌土、无AM真菌和接种AM真菌处理分别显著提高老芒麦叶绿素含量40.42%、22.23%和43.28%(P< 0.05)。不同放牧强度和土壤处理对老芒麦叶绿素含量存在交互效应(P< 0.05), 自然土处理下各放牧强度叶绿素含量显著低于其它土壤处理, 其中, 与自然土处理相比, 灭菌土处理下轻度、中度和重度放牧的老芒麦叶绿素含量分别提高了28.29%、40.27%和52.05%; 无AM真菌处理下轻度、中度和重度放牧分别提高了9.39%、27.78%和28.82%; 较接种AM真菌处理下轻度、中度和重度放牧分别提高了65.44%、40.78%和24.78%(图4)。

放牧强度对老芒麦光合速率无显著影响(P> 0.05)。土壤处理以自然土处理老芒麦光合速率最低, 显著低于其他处理(P< 0.05)。与自然土处理相比, 灭菌土、无AM真菌和接种AM真菌处理分别提高了9.85%、69.36%和102.23%。放牧强度和土壤处理对老芒麦光合速率不存在交互效应(P> 0.05)(图5)。

图4

Fig. 4

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	图4 不同放牧强度处理下老芒麦叶绿素含量Fig. 4 Chlorophyll contents of Elymus sibiricus under different grazing intensities

放牧强度显著影响老芒麦PPO酶活性(P< 0.05), 与轻度放牧相比, 中度放牧和重度放牧显著降低了42.04%和19.45%。各土壤处理以灭菌土处理下老芒麦PPO酶活性最高, 接种AM真菌处理下老芒麦PPO酶活性最低。与灭菌土处理相比, 自然土、无AM真菌和接种AM真菌处理分别降低了13.0%、12.87%和17.26%。不同放牧强度和不同土壤处理对老芒麦PPO酶活性存在交互效应(P< 0.05), 灭菌土处理下各放牧强度老芒麦PPO酶活性显著高于其它土壤处理。其中, 较自然土处理下轻度、中度和重度放牧分别提高了8.18%、7.47%和22.5%; 较无AM真菌处理分别提高了15.44%、14.33%和8.88%; 较接种AM真菌处理下重度和重度放牧分别提高了35.83%和23.81%(图6)。

图5

Fig. 5

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	图5 不同放牧强度处理下老芒麦光合速率Fig. 5 Photosynthetic rates of Elymus sibiricus under different grazing intensities

图6

Fig. 6

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	图6 不同放牧强度处理下老芒麦PPO酶活性Fig. 6 PPO enzyme activities of Elymus sibiricus under different grazing intensities