引用本文
魏淑花, 曹春婧, 朱小芳, 张蓉, 王颖. 豌豆蚜在6个不同抗性苜蓿品种上取食行为的EPG分析. 草业科学, 2017,34(12):2569-2574
Wei Shu-hua, Cao Chun-jing, Zhu Xiao-fang, Zhang Rong, Wang Ying. EPG analysis of Acyrthosiphon pisum feeding behavior on six alfalfa varieties with different resistances . Pratacultural Science,2017,34(12): 2569-2574  
Permissions
Copyright©2017, 《草业科学》编辑部
豌豆蚜在6个不同抗性苜蓿品种上取食行为的EPG分析
魏淑花1, 曹春婧1,2, 朱小芳1,2, 张蓉1, 王颖1
1.宁夏农林科学院植物保护研究所,宁夏 银川 750002
2.宁夏大学农学院,宁夏 银川 750001
通信作者：魏淑花(1980-),女,宁夏同心人,副研究员,硕士,主要从事农业昆虫与害虫防治研究。E-mail:[email protected]
收稿日期: 2017-11-20
基金项目: 宁夏回族自治区农作物重大育种专项——苜蓿新品种选育(2014NYYZ03); 国家牧草产业技术体系——盐池综合试验站 (CARS-34)
摘要

应用刺探电位图谱(electrical penetration graph,EPG)技术研究了豌豆蚜( Acyrthosiphon pisum)在6个不同抗蚜苜蓿( Medicago sativa)品种上的取食行为及不同苜蓿品种的抗蚜机制。结果表明,豌豆蚜在刺吸取食不同抗性苜蓿品种的过程中,均产生8种波形,8种波形在6个苜蓿品种上持续的时间分别不同。与苜蓿品种抗性有关的是豌豆蚜在苜蓿品种韧皮部刺探取食过程中产生韧皮部分泌唾液波(El波)持续的时间,在6个不同抗蚜苜蓿品种上刺吸取食过程中产生E1波持续时间差异显著( P<0.05),抗性越强的苜蓿品种,E1波持续时间越长,在抗性品种MF4020上持续时间最长,为36.8 min,在低抗性品种巨能牧歌37CR持续时间最短,为1.50 min。本研究从电生理方面进一步说明了不同苜蓿品种的抗蚜机制,从而为苜蓿品种抗蚜育种提供了科学依据。

关键词: 苜蓿蚜虫; 刺吸式昆虫; 抗性水平; 刺吸取食; 刺探电位图谱; 抗蚜机制
中图分类号:S816 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2017)12-2569-06 doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2017-0383
EPG analysis of Acyrthosiphon pisum feeding behavior on six alfalfa varieties with different resistances
Wei Shu-hua1, Cao Chun-jing1,2, Zhu Xiao-fang1,2, Zhang Rong1, Wang Ying1
1.Institute of Plant Protection, Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Yinchuan 750002, Ningxia, China
2.Agriculture College, Ningxia University, Yinchuan 750021, Ningxia, China
Corresponding author:Wei Shu-hua E-mail:[email protected]
Abstract

The feeding behavior of Acyrthosiphon pisum on six alfalfa varieties with different resistances, and the resistance mechanisms of these different cultivars, were examined using the electrical penetration graph (EPG) technique. The results showed that there were eight EPG waveforms of aphids feeding on alfalfa leaves, but the durations of the eight waveforms were different between the six cultivars. The resistance of alfalfa was consistent with the duration of the E1 wave, which was produced by A. pisum feeding on the phloem of the alfalfa varieties. The duration of the E1 wave was significantly different between the six different resistances of the alfalfa cultivars; the duration of the E1 wave was longer when the resistance of the alfalfa was stronger. The duration of the E1 wave on the most resistant cultivar was 36.83 min for ‘MF4020’, and the duration of E1 wave on the least resistant cultivar was 1.50 min on ‘Giant pastoral 37CR’.The resistance mechanisms of the different alfalfa cultivars to aphids are further illustrated by electrophysiology in research; it could provide the scientific basis for the breeding of alfalfa varieties with increased resistance to aphids

Keyword: alfalfa aphid; piercing-sucking insects; resistance level; sucking and feeding; electrical penetration graph; resistant mechanism to aphid

豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)是苜蓿(Medicago sativa)的重要害虫之一, 在世界各地均有分布[1, 2, 3]。其喜聚集在苜蓿的细嫩部位吸食汁液, 如嫩茎、嫩梢、幼芽、叶片、花和果实等部位, 使苜蓿叶片卷缩, 变黄, 甚至全株枯死[4]。其分泌的蜜露可引起苜蓿叶片烟煤病, 影响牧草品质; 最为严重的是其传播苜蓿花叶病毒, 因此造成的损失远远超过蚜虫直接危害的损失[5]。国内外有关豌豆蚜生物生态学特性研究及研究现状报道较多[6, 7], 并根据其已筛选出了一些抗豌豆蚜的苜蓿品种[8]。有关苜蓿品种(系)抗豌豆蚜机制研究涉及到苜蓿形态学特征、生化特征等方面[9, 10, 11, 12], 但豌豆蚜在不同抗性苜蓿品种上的取食行为, 即不同抗性苜蓿品种对豌豆蚜取食行为影响的研究尚未见报道。

刺探电位图谱(electrical penetration graph, EPG)技术是一种用来记录刺吸式口器昆虫口针在寄主组织中刺探行为引起的电信号变化特征技术[13, 14], 据昆虫的取食情况可以分析植物不同组织对昆虫的影响, 结合其他试验技术, 将它和昆虫口针在特定植物层次的刺探行为联系起来, 帮助认识植物与刺吸式昆虫之间的相互作用机制[15]。因此, 本研究运用EPG技术对豌豆蚜在6个抗蚜水平不同的苜蓿品种上的取食行为进行研究, 并从电生理方面进一步阐明不同苜蓿品种的抗蚜机制。

1 材料与方法
1.1 供试品种

选用WL343HQ、MF4020、柏拉图、BR4010、WL354HQ和巨能牧歌37CR共6个不同抗性苜蓿品种, 具体来源及抗性分级如表1所列[8]。于2016年5月初将供试的6个苜蓿品种在温室中种于9 cm× 7 cm塑料盆中, 每品种20盆, 每盆5株, 每品种集中放置, 常规管理, 按需浇水。出苗后1 d进行间苗, 每盆保留1棵健壮的苜蓿幼苗, 待苜蓿苗生长至六叶期用于试验。

1.2 供试虫源

从宁夏农林科学院试验地种植的苜蓿植株上采集发育健壮的豌豆蚜成虫。并将其放置在5 ℃的冰箱内冷藏, 进行1 h的饥饿处理后用于试验。

1.3 EPG的转换、记录与分析

采用DC-EPG GIGA-8d(荷兰)8通道昆虫刺探电位图谱记录仪, 将蚜虫与EPG昆虫电极连接, 昆虫电极是一段长2~3 cm、直径18.5 μ m的金丝, 末端用水溶性导电银胶粘在蚜虫前胸背板上。EPG植物电极直接插在苜蓿根茎的土壤中。整个记录系统置于法拉第金属屏蔽罩内, 以防止外源声波的干扰。受试蚜虫饥饿处理1 h后, 于每天10:00开始EPG记录。每头蚜虫的测定时间为5 h, 每一苜蓿品种取有效刺探取食蚜虫10头, 即有效重复数10次进行统计。当蚜虫口针刺入苜蓿组织时, 回路接通, 电流经转换器转换为数字信号, 再由Probe 3.4软件转化成波形图谱输出在电脑屏幕上保存[12]。

1.4 数据处理

将连续记录的EPG数据按不同的行为波形进行分类统计, 再经EPG Stylet analyse 2015将波形图谱转化为相应的数据后, 采用统计分析软件DPS 13.01进行单因素方差分析, 应用Duncan新复极差法进行品种间多重比较。

表1 供试6个苜蓿品种对豌豆蚜抗性级别划分 Table 1 Resistance levels of the six species of alfalfa varieties to Acyrthosiphon pisum
2 结果与分析
2.1 豌豆蚜刺探取食苜蓿品种全过程的EPG波形分析

豌豆蚜刺吸取食不同苜蓿品种共产生8种EPG波形, 以其取食苜蓿品种MF4020为例分析(图1), 非刺探波(np波)表示蚜虫的爬行、休息等行为活动, 路径波A波发生在刺探初始阶段, 其持续时间一般不超10 s, 频率为5~15 Hz, 该波形表示蚜虫口针刚接触叶片表面, 与水溶性唾液分泌有关; B波紧随其后, 1个周期持续时间约5 s, 此时蚜虫口针刺破叶表皮, 位于表皮与薄壁组织之间; C波的主要特征是各个波的频率和振幅差异较大, 此时蚜虫口针在细胞壁组织间穿刺以寻找取食位点, 时间由几秒至2 h不等。pd波反映了口针刺破细胞膜时所测的膜内外电位差, 分3个亚波段:pd-Ⅰ 、pd-Ⅱ 和pd-Ⅲ 。E1波表示蚜虫口针到达筛管后分泌水溶性唾液的相关波形, 持续时间较长; E2波持续时间较短。8种波形中, G波持续时间长, 说明蚜虫在木质部吸食时间比较长, 蚜虫在6种苜蓿品种的刺吸过程中非刺探总时间、pd波次数、E1波持续的总时间等存在显著差异(P< 0.05)。

图1 豌豆蚜取食苜蓿品种MF4020波形 注:Ⅰ , 蚜虫刺探取食过程中的一个整体波形图; Ⅱ , 蚜虫刺探过程中的路径波; Ⅲ , 蚜虫在韧皮部(E1、E2波)和木质部(G波)的取食波形。Fig. 1 EPG waveforms of Acyrthosiphon pisum feeding alfalfa variety Note: Ⅰ , The overview of the waveforms during the process of the probing; Ⅱ , the pathway waveform of aphid; Ⅲ , the aphid feeding waveform of phloem phase (E1, E2) and xylem phase (G).

2.2 豌豆蚜刺吸取食苜蓿品种不同部位的EPG波形分析

2.2.1 豌豆蚜口针到达苜蓿品种韧皮部取食之前的刺探行为 豌豆蚜在6个不同抗性苜蓿品种上开始至第1次到达韧皮部前的刺探次数差异显著(P< 0.05), 豌豆蚜在抗蚜品种MF4020上开始至第1次刺探所需时间与其他5个苜蓿品种间差异显著(P< 0.05), 而其他5个品种间差异不显著(P> 0.05); 5 h监测过程中, 豌豆蚜在低抗品种巨能牧歌37CR上C波的总持续时间最长, 中抗品种柏拉图次之, 抗性品种MF4020最短, 并与低抗品种巨能牧歌37CR和中抗品种柏拉图差异显著(P< 0.05); 抗性品种MF4020的pd波次数最少, 中抗品种BR4010为中抗品种柏拉图的1倍(表2)。

2.2.2 豌豆蚜口针在苜蓿品种木质部的刺探行为 苜蓿品种对豌豆蚜的G波总时间有显著影响(P< 0.05)(表2), 在中抗品种柏拉图上G波持续时间最长, 为108.18 min, 表明在中抗品种柏拉图上豌豆蚜花费在木质部主动摄取汁液的时间大于其他5个品种。

2.2.3 豌豆蚜口针在韧皮部的刺探行为 豌豆蚜在抗蚜品种MF4020、中抗品种柏拉图、BR4010、WL354HQ及低抗品种WL343HQ、巨能牧歌37CR 6个苜蓿品种韧皮部刺探取食过程中, E1波持续的总时间及E1占总E波比例(%)分别为36.83 min、99.23%, 16.7 min、49.8%, 14.6 min、42.4%, 11.0 min、25.9%, 7.97 min、19.9%, 1.50 min、9.99%, 且均差异显著(P< 0.05), 在抗蚜品种MF4020 E1波持续的总时间最长, 为36.83 min, 与中抗品种BR4010、WL354HQ、柏拉图和低抗品种WL343HQ、巨能牧歌37CR差异显著(P< 0.05), 中抗品种与低抗品种巨能牧歌37 CR间差异也显著(P< 0.05), 同一抗性级别内品种间也存在一定差异, 如3个中抗品种中, 柏拉图和BR4010之间差异不显著(P> 0.05), 但其均与WL354HQ差异显著(P< 0.05), 两个低抗品种WL343HQ和巨能牧歌37CR间也差异显著(P< 0.05)(表2); 表明豌豆蚜在抗性品种MF4020韧皮部刺吸过程中需要多次、长时间分泌水溶性唾液, 说明苜蓿品种抗性越强, E1波越长。豌豆蚜在6个不同抗性苜蓿品种的第1次韧皮部持续取食时间也存在显著差异, 抗蚜品种MF4020在第1次韧皮部持续取食时间

表2 豌豆蚜在6个不同抗性苜蓿品种上的EPG参数 Table 2 The EPG parameters of Acyrthosiphon pisum on six alfalfa varieties

注:表中数据为平均数± 标准误。同行数据后不同小写字母表示经Duncan新复极差法检验在P< 0.05水平差异显著。

Note:Data are shown in the table as mean± SE. Different lowercase letters in the same row indicate significant difference at the 0.05 level by least significant difference (LSD) test.

最短, 为6.44 min, 与中抗品种BR4010、WL354HQ、柏拉图和低抗品种WL343HQ、巨能牧歌37CRF均差异显著(P< 0.05)。豌豆蚜在抗蚜品种MF4020上E2波持续的总时间显著短于其他5个品种, 表明豌豆蚜在抗性品种MF4020上用较短时间在韧皮部取食, 说明其在韧皮部存在对豌豆蚜的取食阻碍因素。

3 讨论与结论

本研究采用EPG技术对豌豆蚜在6个不同抗蚜苜蓿品种上的刺探取食行为进行了测定分析。结果表明, 豌豆蚜在刺吸取食不同抗蚜苜蓿品种的过程中均产生8种波形, 分别为非刺探波(np波)、路径波(A、B、C波)、pd波、韧皮部分泌唾液波(El波)、韧皮部被动吸食波(E2波)以及木质部主动吸食波(G波), 8种波形在不同抗蚜苜蓿品种上持续的时间不同, 在6个不同抗蚜苜蓿品种上刺吸取食过程中产生E1波持续时间有差异(P< 0.05), 抗性越强的苜蓿品种, E1波持续时间越长。

刺吸式口器昆虫与寄主植物的对应关系较复杂, 虽然不断有新的波形被发现和描述, 但其结果均证实EPG波形不仅具有稳定性, 同时也有其多样性[16]。本研究中豌豆蚜在6个不同抗蚜苜蓿品种上刺吸取食过程中均无F波(刺吸障碍波)产生, 与郭慧芳等[17]对棉蚜在不同转基因棉上的取食结果和何应琴等[18]研究柑橘(Citrus reticulata)3种蚜虫取食行为的EPG分析结果均一致, 究其原因还需进一步深入研究。

蚜虫在刺吸取食寄主的过程中, 除在韧皮部被动取食植物的营养物质外, 还会在木质部主动取食水分和无机盐而产生G波[19], 豌豆蚜在6个不同抗蚜苜蓿品种上G波持续的总时间均较长, 说明豌豆蚜可能需要补充更多的水分。因此, 为了避免蚜虫缺少水分可以采用室内饲养的方式。

此外, 在试验中存在一些影响豌豆蚜刺吸取食苜蓿的因素, 如金丝束缚限制了豌豆蚜的活动, 常导致EPG波形不能正确反映自然状态下豌豆蚜与苜蓿品种间的相互活动。因此, 利用EPG研究豌豆蚜与不同苜蓿品种间的互作关系, 还需与形态学、组织学技术、蜜露化学成分分析、生物染色液处理植物根系、观察植物表面残留口针中有无汁液溢出、直接观察人工食物中口针的行踪及直接观察昆虫口针在植物组织中的行踪和利用放射性同位素技术等相关研究方法结合, 才能更准确有效地揭示刺探电位波形与豌豆蚜刺探、取食行为及苜蓿品种抗性部位之间的对应关系[20]。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 贺春贵. 苜蓿病虫草鼠害防治. 北京: 中国农业出版社, 2004: 33.
He C G. Prevention and Control of Pests in Afalfa. Beijing: China Agricultural Publishing House, 2004: 33. (in Chinese) [本文引用:]
[2] 张新瑞, 刘长仲, 严林, 陈应武, 魏列新, 钱秀娟. 苜蓿田主要节肢动物种群数量研究. 草地学报, 2007, 15(6): 556-560.
Zhang X R, Liu C Z, Yan L, Chen Y W, Wei L X, Qian X J. Study on the population dynamics of main arthropod groups in alfalfa fields. Acta Agrestia Sinica, 2007, 15(6): 556-560. (in Chinese) [本文引用:]
[3] 徐林波, 刘爱萍, 王慧, 狄彩霞, 王玲玲. 龟纹瓢虫对苜蓿蚜的捕食效应. 草地学报, 2007, 15(3): 296-298.
Xu L B, Liu A P, Wang H, Di C X, Wang L L. Predation of Propylaea japonica on Aphis medicaginis. Acta Agrestia Sinica, 2007, 15(3): 296-298. (in Chinese) [本文引用:]
[4] 杨彩霞, 高立原, 张蓉, 张治科. 宁夏苜蓿蚜虫的发生和综合防治. 宁夏农林科技, 2005, 46(2): 4-7.
Yang C X, Gao L Y, Zhang R, Zhang Z K. Occurrence and comprehensive control of alfalfa aphids in Ningxia. Ningxia Journal of Agriculture and Forestry Science & Technology, 2005, 46(2): 4-7. (in Chinese) [本文引用:]
[5] He C G, Zhang X G. Field evaluation of Lucerne( Medicago sativa L. )for resistance to aphids in northern China. Australian Journal of Agricultural Research, 2006, 57: 471-475. [本文引用:]
[6] 张丽, 袁明龙. 豌豆蚜生物生态学特性. 草业科学, 2017, 34(8): 1727-1740.
Zhang L, Yuan M L. Biological and ecological characteristics of Acyrthosiphon pisum. Pratacultural Science, 2017, 34(8): 1727-1740. (in Chinese) [本文引用:]
[7] 张奔, 周敏强, 王娟, 蒲毅, 张丽, 袁明龙. 我国苜蓿害虫种类及研究现状. 草业科学, 2016, 33(4): 785-812.
Zhang B, Zhou M Q, Wang J, Pu Y, Zhang L, Yuan M L. Species checklist and research status of alfalfa insect pests reported in China. Pratacultural Science, 2016, 33(4): 785-812. (in Chinese) [本文引用:]
[8] 马建华, 魏淑花, 张洪英, 张蓉, 李克昌, 罗晓玲, 张宇. 宁夏主栽苜蓿品种(系)对豌豆蚜的抗性评价. 草业学报, 2016, 25(6): 190-197.
Ma J H, Wei S H, Zhang H Y, Zhang R, Li K C, Luo X L, Zhang Y. An evaluation of the main cultivated Medicago sativa cultivars (strains) for Acyrthosiphon pisum resistance in Ningxia. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(6): 190-197. (in Chinese) [本文引用:]
[9] 黄伟, 贾志宽, 韩清芳. 蚜虫( Aphis medicaginis Koch)危害胁迫对不同苜蓿品种体内丙二醛含量及防御性酶活性的影响. 生态学报, 2007, 27(5): 2177-2181.
Huang W, Jia Z K, Han Q F. Effects of herbivore stress by Aphis medicaginis Koch on the contents of MDA and activities of protective enzymes in different alfalfa varieties. Acta Ecologica Sinica, 2007, 27(5): 2177-2181. (in Chinese) [本文引用:]
[10] 许永霞. 苜蓿品种( 系)对苜蓿斑蚜的抗性机制. 兰州: 甘肃农业大学硕士学位论文, 2008.
Xu Y X. Resistance mechanism of alfalfa varieties(lines)to Therioaphis trifolii. Master Thesis. Lanzhou: Gansu Agricultural University, 2008. (in Chinese) [本文引用:]
[11] 武德功, 杜军利, 王森山, 胡桂馨, 贺春贵. 4个苜蓿品种对豌豆蚜的抗性评价. 草业科学, 2012, 29(1): 101-104.
Wu D G, Du J L, Wang S S, Hu G X, He C G. Evaluation on resistance of 4 alfalfa( Medicago sativa)cultivars to pea aphid( Acyrthosiphon pisum). Pratacultural Science, 2012, 29(1): 101-104. (in Chinese) [本文引用:]
[12] 张洪英, 魏淑花, 张蓉, 苗润, 李克昌, 罗晓玲, 张宇. 豌豆蚜为害对苜蓿品种酶活性和营养物质的影响. 草业科学, 2016, 33(1): 144-152.
Zhang H Y, Wei S H, Zhang R, Miao R, Li K C, Luo X L, Zhang Y. Effects of Acyrthosiphon pisum on enzyme activities and nutrients of different alfalfa varieties. Pratacultural Science, 2016, 33(1): 144-152. (in Chinese) [本文引用:]
[13] Tjallingii W F. Electrical nature of record signals during styled penetration by aphids. Entomologia Experimentalis et Applicata, 1985, 38: 177-186. [本文引用:]
[14] 胡想顺, 刘小凤, 赵惠燕. 刺探电位图谱(EPG)技术的原理与发展. 植物保护, 2006, 32(3): 1-4.
Hu X S, Liu X F, Zhao H Y. Development and application of electrical penetration graph(EPG)technique. Plant Protection, 2006, 32(3): 1-4. (in Chinese) [本文引用:]
[15] 苗进, 武予清, 郁振兴, 段云, 蒋月丽, 李国平. 基于EPG的麦长管蚜、麦二叉蚜和禾谷缢管蚜取食行为比较. 生态学报, 2011, 31(1): 175-182.
Miao J, Wu Y Q, Yu Z X, Duan Y, Jiang Y L, Li G P. Comparative of feeding behaviors of Sitobion avenae, Sitobion graminum and Rhopalosiphum padi(Homoptera: Aphididae)using electrical penetration graph(EPG). Acta Ecologica Sinica, 2011, 31(1): 175-182. (in Chinese) [本文引用:]
[16] 罗晨, 岳梅, 徐洪富, 张芝利. EPG 技术在昆虫学研究中的应用及进展. 昆虫学报, 2005, 48(3): 437-443.
Luo C, Yue M, Xu H F, Zhang Z L. Application of electrical penetration graph (EPG) in entomological studies and new findings. Acta Entomologica Sinica, 2005, 48(3): 437-443. (in Chinese) [本文引用:]
[17] 郭慧芳, 朱述钧, 孙洪武, 方继朝. 转基因棉上非靶标害虫棉蚜取食行为的EPG研究. 西南农业大学学报(自然科学版), 2004, 26(2): 155-158.
Guo H F, Zhu S J, Sun H W, Fang J C. Electrical penetration graph of feeding behavior of non-target pest Aphis gossypii on transgenic cotton. Journal of Southwest Agricultural University (Natural Science), 2004, 26(2): 155-158. (in Chinese) [本文引用:]
[18] 何应琴, 陈文龙, 鲁卓越, 周常勇, 李中安, 李太盛. 柑橘三种蚜虫取食行为的EPG分析. 植物保护学报, 2015, 42(2): 217-222.
He Y Q, Chen W L, Lu Z Y, Zhou C Y, Li Z A, Li T S. EPG analysis of feeding behavior of three aphids on Citrus reticulate. Journal of Plant Protection, 2015, 42(2): 217-222. (in Chinese) [本文引用:]
[19] Spiller N J, Koenders L, Tjallingii W F. Xylem ingestion by aphids-astrategy for maintaining water balance. Entomologia Experimentalis et Applicata, 1990, 55: 101-104. [本文引用:]
[20] 陈建明, 俞晓平, 程家安, 吕仲贤, 郑许松, 徐红星. 定量研究刺吸式昆虫取食行为的有效方法: 电子取食监测仪的原理和应用技术. 浙江农业学报, 2002, 14(4): 237-243.
Chen J M, Yu X P, Cheng J A, Lyu Z X, Zheng X S, Xu H X. Principle and application of electronic monitoring system: An effective and quantitative method in the study of probing and feeding behaviors of piercing-sucking insects. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2002, 14(4): 237-243. (in Chinese) [本文引用:]