试验材料为甘肃农业大学草业学院选育的饲草型小黑麦新品系P2种子。

将花卉土与大田土以1∶ 1混合, 装入花盆(直径20 cm, 深度15 cm)中, 用水浇透, 3~4 d后每个花盆中种植饲草型小黑麦种子45粒。每隔7 d浇一次水。饲草型小黑麦进入三叶期时采用PEG模拟水分干旱胁迫。PEG浓度(A因素)设5个水平, A₁(0, CK), A₂(10%), A₃(20%), A₄(30%), A₅(40%), 干旱胁迫天数(B因素)设4个水平, B₁(7 d), B₂(14 d), B₃(21 d), B₄(28 d)。每个处理设4次重复, 共80盆, 用于采集测定生理生化指标的样品。

试验开始时, A₂、A₃、A₄和A₅处理的花盆分别用相应浓度的PEG溶液浇透, 对照(CK)浇水200 mL, 并称重。之后每隔7 d从不同PEG浓度处理的花盆中分别剪取叶片用于测定生理生化指标, 并用恒重法补充各个处理蒸发的水分, CK每次补充200 mL水。将剪取的样品带回实验室, 测定叶片含水量、相对含水量、丙二醛、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、可溶性糖和游离脯氨酸含量^[16]。

叶片含水量采用烘干法测定, 相对含水量采用浸泡法测定, MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定, 游离脯氨酸含量采用水合茚三酮法测定, 可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定, 叶绿素含量利用分光光度法测定^{[17, 18, 19, 20]}。以上指标均重复测定4次, 取平均值。

用SPSS 19.0软件中二因素随机区组试验设计的统计方法, 分别分析小黑麦在不同PEG浓度和干旱胁迫天数下叶片的含水量、相对含水量、相对电导率、丙二醛含量、叶绿素a、b含量、类胡萝卜素含量、可溶性糖含量和游离脯氨酸含量的差异显著性。如果差异显著, 分别用Duncan法进行多重比较。用Excel进行数据整理和作图。

PEG浓度对饲草型小黑麦苗期叶片含水量、相对含水量、叶绿素b含量、游离脯氨酸含量和丙二醛含量有极显著影响(P< 0.01)(表1), 而对叶片的相对电导率、可溶性糖含量、叶绿素a和类胡萝卜素含量无显著影响(P> 0.05)。这说明叶片的相对电导率、可溶性糖含量、叶绿素a和类胡萝卜素含量不适宜作为饲草型小黑麦苗期抗旱性评价的指标。干旱胁迫天数对叶片的相对电导率和类胡萝卜素含量无显著影响, 说明不能用这两个指标筛选饲草型小黑麦苗期抗旱性评价的干旱胁迫天数。PEG浓度与干旱胁迫天数的交互作用对饲草型小黑麦苗期叶片相对含水量, 相对电导率无显著影响, 结合PEG浓度和干旱胁迫天数方差分析的结果, 相对电导率、叶绿素a、类胡萝卜素和可溶性糖不作为抗旱性评价指标。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 饲草型小黑麦苗期生理生化指标方差分析表(F值) Table 1 ANOVA comparing physiological and biochemical indices of triticale(F value) 变异来源 Source of variation df F值 含水量 MC 相对含 水量 RMC 相对电 导率 REC 叶绿素a Chlorophyll a 叶绿素b Chlorophyll b 类胡萝卜素 Carotenoids 可溶性糖 Soluble sugar 游离脯 氨酸 Pro 丙二醛 MDA PEG浓度 PEG concentration 4 31.494* * 10.854* * 1.436 1.187 5.967* * 2.406 1.293 10.839* * 12.748* * 干旱胁迫天数 Drought stress days 3 4.804* * 6.184* * 0.913 3.922* 5.563* * 2.372 9.204* * 39.033* * 19.662* * PEG浓度× 干旱胁迫天数 PEG concentration× Drought stress days 12 3.036* * 1.700 1.106 2.508* 2.849* * 2.926* * 2.067* 2.830* * 4.396* * Note:* * means significant difference at the 0.01 level, * means significant difference at the 0.05 level. MC, RMC, REC, Pro and MDA indicate moisture content, relative moisture content, relative electricl conductivity, content of proline, content of malondialdehyde. 注:* * 表示达到极显著水平(P< 0.01), * 表示差异显著水平(P< 0.05)。

表1 饲草型小黑麦苗期生理生化指标方差分析表(F值) Table 1 ANOVA comparing physiological and biochemical indices of triticale(F value)

随着PEG浓度增加, 饲草型小黑麦叶片含水量呈下降趋势, 30%和40%PEG胁迫下的叶片含水量和对照(CK)差异显著(P< 0.05)(表2), 30%PEG胁迫下叶片含水量显著高于40%PEG胁迫。随着PEG浓度增加, 相对含水量亦下降, 浓度为30%和40%时, 和CK有显著差异(P< 0.05), 40%PEG胁迫下相对含水量显著低于20%PEG胁迫。40%PEG胁迫下饲草型小黑麦叶片叶绿素b含量显著低于CK和10%、20%及30%PEG胁迫(P< 0.05), 与CK相比下降了25.81%。除20%PEG外随着PEG浓度增加, 饲草型小黑麦叶片丙二醛含量逐渐增加, 40%PEG处理的丙二醛含量最高, 显著高于CK和10%、20%及30%PEG胁迫(P< 0.05)。随着PEG浓度增加, 饲草型小黑麦叶片游离脯氨酸含量逐渐增加, PEG浓度≥ 20%时和CK存在显著差异(P< 0.05)。从不同浓度PEG处理下各生理指标与CK的差异显著性可知, 30%PEG为饲草型小黑麦苗期抗旱性评价的适宜浓度。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 PEG浓度对饲草型小黑麦生理生化指标的影响 Table 2 Effect of PEG concentration on physiological and biochemical indexes of triticale 生理生化指标 Physiological biochemical index PEG浓度 PEG concentration/% 0(CK) 10 20 30 40 含水量 Moisture content/% 85.31± 1.06a 81.38± 1.97a 79.09± 2.85a 76.60± 2.49b 67.28± 2.35c 相对含水量 Relative moisture content/% 62.49± 6.04ab 70.30± 5.07a 54.15± 3.39bc 48.73± 4.53cd 38.92± 4.92d 叶绿素b Content of chlorophyll b/mg· g-1 12.71± 1.29a 14.39± 0.66a 12.07± 0.74a 14.18± 0.75a 9.43± 0.75b 丙二醛含量 Malondialdehyde content/μ mol· g-1 4.83± 0.53b 4.99± 0.62b 4.74± 0.54b 6.20± 0.77b 9.30± 1.46a 游离脯氨酸含量 Proline content/μ g· g-1 383.24± 14.69b 394.01± 11.51b 417.37± 17.18a 435.18± 8.57a 434.48± 8.00a Note:Different letters within the same row mean significant differences among different PEG concentrotion at 0.05 level. The same below. 注:同行不同字母表示不同PEG浓度间差异显著(P< 0.05)。下同。

表2 PEG浓度对饲草型小黑麦生理生化指标的影响 Table 2 Effect of PEG concentration on physiological and biochemical indexes of triticale

随着干旱胁迫天数的增加(除21 d外), 饲草型小黑麦叶片含水量呈下降趋势(表3), 14和28 d干旱胁迫下的叶片含水量与CK有显著差异(P< 0.05)。随着干旱胁迫天数增加(除21 d外), 相对含水量亦下降, 干旱胁迫28 d时与CK有显著差异, 下降了26.59%。干旱胁迫14、21、28 d时饲草型小黑麦叶片叶绿素b的含量显著低于CK。随着干旱胁迫时间的延长(除7 d外), 饲草型小黑麦叶片丙二醛的含量逐渐增加, 干旱胁迫14、21、28 d的丙二醛含量和CK差异显著。随着干旱胁迫时间延长, 饲草型小黑麦叶片游离脯氨酸含量的变化与丙二醛相似, 干旱胁迫14、21、28 d显著高于CK。综合分析不同干旱胁迫天数下各生理指标与CK的差异显著性可知, 28 d为饲草型小黑麦苗期抗旱性评价的适宜胁迫天数。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 干旱胁迫天数对饲草型小黑麦生理生化指标的影响 Table 3 Effects of drought stress on physiological biochemical indexes of triticale 生理生化指标 Physiological biochemical indexes 干旱胁迫天数Drought stress days/d 0(CK) 7 14 21 28 含水量 Moisture content/% 85.20± 1.00a 80.81± 0.11a 75.97± 0.87b 77.82± 0.95ab 74.36± 0.12b 相对含水量 Relative moisture content/% 62.95± 6.49a 59.07± 2.39a 52.86± 6.18ab 59.23± 6.07a 46.18± 4.05b 叶绿素b Content of chlorophyll b/mg· g-1 12.71± 1.29a 14.94± 0.62a 12.51± 1.21b 12.37± 0.88b 11.10± 0.66b 丙二醛 Malondialdehyde content/μ mol· g-1 4.83± 0.53b 2.78± 0.17b 7.10± 0.48a 6.61± 0.50a 8.28± 1.51a 游离脯氨酸 Proline content/μ g· g-1 383.24± 14.69b 365.02± 6.93b 440.91± 10.83a 429.77± 8.40a 439.14± 5.36a

表3 干旱胁迫天数对饲草型小黑麦生理生化指标的影响 Table 3 Effects of drought stress on physiological biochemical indexes of triticale

2.4.1 小黑麦叶片含水量 随着干旱胁迫时间延长和PEG浓度增加, 叶片含水量降低(图1)。CK处理(A₁B₁, A₁B₂, A₁B₃, A₁B₄)的饲草型小黑麦在试验过程中生长正常, 其叶片含水量变化不大(82.77%~87.45%)。经不同浓度PEG处理后, 饲草型小黑麦叶片表现出不同程度萎蔫, 萎蔫程度随胁迫强度和胁迫时间的延长而加重, 甚至枯死。30%和40%PEG溶液胁迫至14 d时, 植株上部叶片枯萎, 叶片含水量和CK(A₁B₂)存在显著差异(P< 0.05), 干旱胁迫21和28 d时, 30%和40%PEG胁迫下的叶片含水量显著低于10%PEG胁迫, 说明30%和40%PEG进一步加重了饲草型小黑麦的干旱胁迫。

图1

干旱胁迫对饲草型小黑麦叶片含水量的影响

Effects of PEG stress on moisture content in triticale leaf

注:不同小写字母表示处理间差异显著(P< 0.05)。下同。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments at the 0.05 level; similarly for the following figures.

2.4.2 小黑麦叶片的叶绿素b含量 用不同浓度PEG对饲草型小黑麦幼苗胁迫7 d后, 叶片中的叶绿素b含量(12.79~15.75 mg· g^-1)与CK(A₁B₁)均无显著差异(P> 0.05)(图2); 胁迫14和21 d后, 40% PEG处理(A₅B₂, A₅B₃)的叶绿素b含量和CK(A₁B₂, A₁B₃)含量相比分别下降26.07%和30.68%; 胁迫28 d后, 叶片叶绿素b含量随着PEG浓度的增大先增加再减小, 各PEG浓度和CK(A₁B₄)间无显著差异。

图2

Fig. 2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 干旱胁迫对饲草型小黑麦叶片叶绿素b含量的影响Fig. 2 Effects of PEG drought stress on the content of chlorophyll b in triticale leaf

2.4.3 小黑麦叶片的游离脯氨酸含量 游离脯氨酸含量随着PEG浓度的增大而增加, 干旱胁迫7 d后, 30%和40%PEG处理(A₄B₁, A₅B₁)叶片的游离脯氨酸含量显著高于CK(A₁B₁)(P< 0.05)(图3); 干旱胁迫14 d后, 20%、30%和40%PEG处理(A₃B₂, A₄B₂, A₅B₂)叶片的游离脯氨酸含量显著高于CK(A₁B₂); 干旱胁迫21 d后, 40%PEG处理(A₅B₃)的叶片游离脯氨酸含量显著高于CK(A₁B₃); 不同浓度PEG对饲草型小黑麦幼苗胁迫28 d后, 叶片中的游离脯氨酸含量(419.52~452.27 μ g· g^-1)均与CK(A₁B₄)无显著差异(P> 0.05)。

2.4.4 小黑麦叶片的丙二醛含量 不同质量浓度PEG对饲草型小黑麦胁迫7、14、21 d后, 叶片中的丙二醛含量与相应CK(A₁B₁, A₁B₂, A₁B₃)差异均不显著(P> 0.05)(图4); 胁迫28 d后, 40%PEG处理的叶片中丙二醛含量(17.46 μ mol· g^-1)显著大于CK(A₁B₄)(P< 0.05), 与CK相比, 含量上升了237.17%。

图3

Fig. 3

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	图3 干旱胁迫对饲草型小黑麦叶片游离脯氨酸含量的影响Fig. 3 Effects of PEG drought stress on the proline content in triticale leaf

图4

Fig. 4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 干旱胁迫对饲草型小黑麦叶片丙二醛含量的影响Fig. 4 Effects of PEG drought stress on the MDA content in triticale leaf

利用PEG研究饲草型小黑麦抗旱性的关键是适宜的PEG浓度和胁迫时间。有研究表明, 0.2 kg· L^-1的PEG-6000胁迫8 d为最佳模拟紫斑牡丹(Paeonia rockii)的抗旱性条件^[17], 该模拟条件下, 紫斑牡丹叶片的叶绿素a、相对电导率、游离脯氨酸含量变化较大, 可作为评价紫斑牡丹抗旱性的候选指标。另有研究表明, 以20%的PEG胁迫9 d可作为最佳模拟抗旱条件来研究白芷(Angelica dahurica)苗期的抗旱性^[21]。本研究结果表明, 饲草型小黑麦的一些生理指标在PEG浓度较低、胁迫时间较短时对干旱胁迫的响应不敏感, 如20%PEG胁迫14 d时, 对饲草型小黑麦叶片的含水量, 丙二醛和叶绿素b含量的影响较小。反之, 如果PEG浓度较高、胁迫时间较长, 就会超过饲草型小黑麦的最大耐受强度, 致使植株萎蔫, 甚至死亡。随着胁迫时间延长, 饲草型小黑麦能耐受低浓度PEG干旱胁迫, 但高浓度干旱处理可对其造成严重危害, 如40%PEG胁迫28 d时, 叶片相对含水量较低, 叶片枯萎严重。本研究还发现, 用30%和40%PEG胁迫21和28 d时, 饲草型小黑麦各指标的变化较明显。丙二醛是植物膜脂过氧化降解的产物, 也是表征植物细胞膜受氧化伤害程度的重要指标^[14]。当饲草型小黑麦干旱胁迫28 d时, 丙二醛含量急剧上升, 说明饲草型小黑麦可以承受一定时间限度的干旱胁迫, 当超过该承受限度后, 就不能充分发挥渗透调节系统的作用, 细胞膜系统受到损伤, 影响植株正常生长^[19]。用30%PEG胁迫28 d时, 大多数指标值与CK有显著差异, 并且植株枯萎的较轻。综合以上各因素认为, 研究饲草型小黑麦苗期抗旱性的最佳模拟条件为以30%PEG胁迫处理28 d。

植物抗旱性的评价指标较多, 许多研究表明, 丙二醛、相对电导率和植物抗旱性有显著相关性^{[22, 23, 24]}。在玉米(Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)的研究中表明, 不同作物品种间存在着渗透调节能力差异, 抗旱性强品种的渗透调节能力比抗旱性弱品种大, 其可溶性糖、游离脯氨酸等渗透调节物质的含量增加也较快^[25]。小麦不耐旱品种比耐旱品种叶片的叶绿素含量更低^[26]。水稻( Oryza sativa)开花期叶片的相对含水量、游离脯氨酸含量与抗旱性有显著相关性, 可作为鉴定水稻开花期抗旱性的指标^[27]。糜子(Panicum miliaceum)叶片中的叶绿素含量可作为鉴定其抗旱性的有效指标^[28]。抗坏血酸过氧化物酶(APX)、SOD、CAT、可溶性蛋白(SPr)的相对值和油菜(Brassica campestris)苗期抗旱性呈显著正相关关系, 可作为鉴定苗期油菜的抗旱性指标^[29]。本研究选取9个指标研究饲草型小黑麦苗期的抗旱性, 结果表明, 随着PEG胁迫程度的加剧, 叶片含水量、相对含水量、丙二醛、叶绿素b和游离脯氨酸含量和CK有显著差异, 可以作为饲草型小黑麦苗期抗旱性鉴定的指标。但随着PEG浓度和胁迫时间的变化, 叶片的可溶性糖、相对电导率、叶绿素a和类胡萝卜素含量均无显著差异, 说明以上4指标不适宜作为评价饲草型小黑麦苗期抗旱性的指标。但值得注意的是, PEG模拟的干旱胁迫和自然界中干旱情况不同, 并且盆栽环境和野生环境也有些差异, 因此, 有必要研究饲草型小黑麦在自然条件下的抗旱性, 使其真实的抗旱能力能够被充分反映, 为饲草型小黑麦的实际栽培应用提供理论依据^[17]。

幼苗期是饲草型小黑麦由营养生长向生殖生长和生态生长发展的一个重要转折点, 直接关系到饲草型小黑麦的成苗率与后期作物产量^[30]。干旱胁迫下油菜的游离脯氨酸含量增加132.06%~938.44%, 平均增加642.50%, 极显著高于对照^[29]。随着干旱胁迫程度加剧, 糜子叶片丙二醛含量和对照相比有不同程度提高^[31], 相对含水量也有不同程度降低。

本研究表明, 饲草型小黑麦幼苗在干旱胁迫情况下, 其生长和生理指标有明显差异, 生理生化指标如叶片含水量、游离脯氨酸含量、相对含水量等在饲草型小黑麦体内呈一定变化规律, 这和受胁迫的程度、胁迫时间有密切关系, 这些生理生化指标和抗旱性关系明确, 和前人研究结果相似^{[30, 31]}。本研究采用不同浓度PEG人工模拟生理干旱, 分析饲草型小黑麦生长初期的生理生化指标, 确定干旱胁迫下各指标的变化趋势和抗旱性鉴定指标以及抗旱性的最佳模拟条件, 但这只是对小黑麦生长初期的研究, 有关饲草型小黑麦分蘖期、灌浆期、成熟期的抗旱性鉴定指标以及抗旱性的最佳模拟条件有待进一步研究。