紫花苜蓿种子WL168HQ购于北京正道生态科技有限公司, 秋眠级2, 适用于放牧及干草生产。接种摩西球囊霉菌(Glomus mosseae)由中国农业大学资源与环境学院提供。10 g沙土样品菌剂孢子数平均为216个。

试验于中国农业大学资源与环境学院温室进行, 温室的温度变化范围为28~38 ℃。试验采取三因素完全随机试验设计。试验水分处理:充足水分(W₁, 田间持水量75%~80%)、轻度干旱(W₂, 田间持水量55%~60%)、中度干旱(W₃, 田间持水量35%~40%)、重度干旱(W₄, 田间持水量15%~20%); 磷施加量浓度:P₁, 无磷Hogland营养液; P₂, 0.25 mmol· L^-1 KH₂PO₄ Hogland营养液; P₃, 0.5 mmol· L^-1 KH₂PO₄ Hogland营养液; 以及是否接种AMF。共24个处理, 每个处理4个重复, 共计96盆。

试验开始前, 每盆(花盆上口径19 cm, 下口径14.5 cm, 高18 cm)装未施肥低磷土壤(pH 6.9), 过2 mm筛后按河沙与土1:1(质量比)混匀, 培养土基本养分状况:全氮0.7 g· kg^-1, 速效磷5.4 mg· kg^-1, 全钾12.3 mg· kg^-1。所有培养基质均在中国农业科学院原子能所用γ 射线(25 kGy)灭菌处理, 装土前将苗、盆用无水乙醇消毒, 每盆装入3.5 kg培养土。一半盆栽中加入20 g摩西球囊霉菌, 另一半加入等量γ 射线灭菌菌剂。于5月18日播种, 每盆点播40粒种子, 于5月31号间苗, 每盆留15株长势均一的苜蓿幼苗以备试验测定。植株正常生长25 d后进行干旱胁迫, 采用称重法控制水分。在试验的第1、15、30天时分别将P₁:无磷Hogland营养液、P₂: 0.25 mmol· L^-1 KH₂PO₄ Hogland营养液、P₃:0.5 mmol· L^-1 KH₂PO₄ Hogland营养液施加在不同植株中, 每次施加150 mL。在胁迫25 d时对株高和土壤含水量进行测量, 并分别剪取叶片, 将其放于冰盒内带回实验室, 并储藏于-80 ℃冰箱中, 用于测定叶片含水量、丙二醛等生理指标, 剩余5株幼苗整株取样, 65 ℃烘干24 h, 用于测定生物量。从每个盆栽中取出10条完整的根, 先用自来水清洗干净, 再用去离子水多次冲洗, 最后用吸水纸将多余水分去除, 选取新鲜根系进行测定菌根侵染率。

紫花苜蓿的株高采用卷尺测量基部到植株最高部位的自然距离; 叶片相对含水量采用烘干称量法测定; 根茎比(root/shoot)为地下生物量和地上生物量的比值, 菌根侵染率采用台盼蓝染色法测定^[12], 光合指标用Li-6400进行测定, 超氧化物歧化酶(SOD)采用氮蓝四唑(NBT)法测定^[13], 脯氨酸(Pro)采用茚三酮法测定^[14], 丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法测定^[15]。

试验数据采用SPSS 22.0软件进行分析, 对植物的抗干旱胁迫能力的测定采用t检验, 其余指标采用One-Way ANOVA进行方差分析。不同处理间的交互作用及影响采用一般线性模型进行分析, 用Ducan法进行多重比较, 试验结果为平均值± 标准差(SD)。* , P< 0.05; * * , P< 0.01; * * * , P< 0.001。

结果表明, 随着水分胁迫的加剧, 无论是否接种AMF, 紫花苜蓿的株高均显著下降(P< 0.05)。在W₁、W₂的水分条件下株高显著高于在W₃、W₄的水分条件下的株高(P< 0.05)。在W₁和W₂处理组, 接种AMF的紫花苜蓿株高均显著(P< 0.05)高于未接种AMF(图1)。在未接种AMF的W₁处理下, P₃处理组的株高均显著高于P₂; 随着水分的降低, 这种差异逐渐减小, 各个磷处理间差异不显著; 且在W₁条件下, 高浓度磷处理会显著提高株高。而在接种AMF的条件下, 磷浓度对植株高度无显著影响。据此推测, 植株高度对不同水分、AMF、磷条件响应不同。

图1

Fig. 1

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图1 不同水分、磷浓度下接种菌根真菌后紫花苜蓿株高 W:不同程度干旱胁迫处理; W-A:不同程度干旱胁迫+接种AMF处理; W-P2:不同程度干旱胁迫+P2浓度磷处理; W-P3:不同程度干旱胁迫+P3浓度磷处理; W-P2-A:不同程度干旱胁迫+P2浓度磷+接种AMF处理; W-P3-A:不同程度干旱胁迫+P3浓度磷+接种AMF处理。不同小写字母表示不同干旱协迫处理间差异显著(P< 0.05)。下同。Fig. 1 Plant height of alfalfa under different water and phosphorus concentrations and inoculation of mycorrhizal fungi W: different degrees of drought stress; W-A: different degrees of drought stress+AMF inoculation; W-P2: different degrees of drought stress+P2 concentration of phosphorus treatment; W-P3: different degrees of drought stress+P3 concentration of phosphorus treatment; W-P2-A: different degrees of drought stress+P2 concentration of phosphorus+AMF treatment; W-P3-A: different degree of drought stress+P3 concentration of phosphorus+AMF inoculation. Different lowercase letters mean significant difference among different water treatments at the 0.05 level; similarly for the following figures.

在各个水分梯度下, 施加P₂和P₃处理组菌根侵染率显著高于无磷处理组(P< 0.05)。而在W₁、W₂的水分梯度下, 施磷后植株菌根侵染率显著高于W₃、W₄水分梯度(图2)。由此可知, 施加磷处理会显著提高对植株的菌根侵染率。

图2

Fig. 2

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	图2 不同水分、磷浓度下接种菌根真菌后紫花苜蓿菌根侵染率Fig. 2 Alfalfa mycorrhiza infection rate under different water & phosphorus concentrations and inoculation of mycorrhizal fungi

不同干旱胁迫对生物量的影响不显著(P> 0.05)。在相同干旱胁迫条件下, 不同浓度磷处理在对紫花苜蓿地上生物量和地下生物量影响不显著(P> 0.05)。在磷浓度相同时, 紫花苜蓿的地上生物量随水分的降低而降低。接种AMF在W₁和W₂时地上地下生物量明显高于未接种AMF组, 在W₃和W₄时地上生物量变化与未接种AMF相比差异不显著。而不同处理对地下生物量未产生显著影响。

图3

Fig. 3

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	图3 不同水分、不同磷浓度条件下接种菌根真菌后紫花苜蓿生物量Fig. 3 Alfalfa biomass under different moisture & phosphorus concentrations after inoculation of mycorrhizal fungi

相对含水量是干旱条件下细胞脱水的一个重要指标。随着干旱胁迫程度的加剧, 各处理组叶片的相对含水量均显著下降(P< 0.05)。而各处理组中, 无论是否接种AMF, 磷浓度的变化对叶片相对含水量未产生显著影响。W₃条件下接种AMF, 可以显著的增加叶片的相对含水量(P< 0.05), 且提高在低水分处理下的叶片持水能力; 当水分胁迫加剧时, 磷的添加和AMF侵染可以有效地增加苜蓿叶片中相对含水量。施加P₂并接种AMF相对于同水平上未接种AMF相对水分含量增加了73.08%。

图4

Fig. 4

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	图4 不同水分、不同磷浓度下接种菌根真菌后紫花苜蓿叶片相对含水量Fig. 4 Relative water content of alfalfa leaves under different moisture & phosphorus concentrations after inoculation of mycorrhizal fungi

2.5.1 不同处理对叶片MDA含量的影响 随着干旱胁迫程度的加剧, 紫花苜蓿叶片中MDA含量呈增加趋势, 且在W₄时达到最大值(图5)。而不同磷浓度在轻度干旱状况下(W₃)对紫花苜蓿MDA含量有一定抑制作用(P< 0.05), 而在其他处理组中影响不显著(P> 0.05)。在相同水分条件下添加AMF后对比未添加AMF处理组, MDA变化不显著(P> 0.05)。

图5

Fig. 5

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	图5 不同水分、不同磷浓度条件下接种菌根真菌后紫花苜蓿体内MDA含量Fig. 5 MDA content in alfalfa under different water & phosphorus concentrations and inoculation of mycorrhizal fungi

2.5.2 不同处理对叶片SOD活性的影响 随着水分胁迫的增加, SOD活性显著下降(P< 0.05)(图6)。但在W₂、W₃水分梯度条件下, 添加AMF后SOD的活性都显著高于未添加AMF的处理(P< 0.05)。而在P₃条件处理下, 植株内SOD活性相较于P₂处理组显著下降(P< 0.05)。

图6

Fig. 6

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	图6 不同水分、不同磷浓度下接种菌根真菌对紫花苜蓿体内SOD活性量的影响Fig. 6 SOD activity in alfalfa under different water & phosphorus concentrations and inoculation of mycorrhizal fungi

干旱胁迫会导致幼苗发育缓慢。本研究中, 低于正常水分条件下生长的幼苗长度均被抑制, 且抑制作用随着干旱胁迫的加剧而显著增强。接种AM真菌后可以显著地减缓紫花苜蓿因水分胁迫导致株高降低趋势, 这与于洁等^[16]的研究结论一致。而与未施加磷的对照组相比, 接种AMF且施加0.25 mmol· L^-1 KH₂PO₄处理组株高和地上生物量显著增加, 说明接种AMF可以有效缓解干旱对紫花苜蓿生长的抑制作用。在接种AMF且0.5 mmol· L^-1 KH₂PO₄营养液处理下, 株高增加显著。这可能是由于磷参与了植株的光合作用, 施加磷最利于叶绿体合成光合作用产物, 进而促进了植株高度的增加; 但与0.25 mmol· L^-1 KH₂PO₄组对比株高增加不显著, 且地上生物量增长亦不显著。因此, 无法证明这两个梯度磷水平可以改善植株的抗旱性能。而高浓度磷添加的营养液并未显著提高植株的菌根侵染率, 甚至还有所下降, 这可能是由于在高磷条件下, 随着寄主植物磷营状况的改善, 菌根真菌的菌丝生长受到抑制, 因而降低了菌根侵染率^[17]。研究发现, 干旱胁迫下, 在所有磷浓度处理条件下施用AMF均可以增加紫花苜蓿的地上生物量, 提高植株的持水能力, 使紫花苜蓿能在水分亏缺条件下维持生长。这与石伟琦等^[18]施用AMF促进紫花苜蓿生物量的结论相一致, 而与李重祥^[19]在紫花苜蓿上的研究不完全一致, 可能是因为选用不同菌种与不同寄主植物的亲和效应不同, 从而产生了不同的试验结果。

叶片相对含水量是反映植物水分状况的重要生理指标。在干旱胁迫条件下, 接种丛枝菌根真菌显著地提高了叶片中的相对含水量, 因为AMF在根系周围形成的菌丝体网络可以帮助植物从更深的土层、更小的土壤缝隙中汲取更多的水分, 菌丝体网络也增大了根系与土壤的接触面积^[20]。本研究得出紫花苜蓿叶片中相对水分含量的改变, 主要是通过水、磷和AMF三者间的互作进行调控; 水分条件较好(W₁、W₂), 接种AMF, 且施0.5 mmol· L^-1 KH₂PO₄营养液时, 植株叶片持水能力较强, 结合前人研究表明, 施入磷肥有利于水分的吸收利用^[21]。而当水分胁迫增加时(W₃、W₄), 菌根的形成受到水分不足和磷浓度过高的抑制, 可能影响菌丝活性, 在深度干旱条件下也影响了植株根系的生长。随着水分的不断减少, 植物产生MDA等有害物质逐渐增多, MDA可作为植物膜损伤的主要指标, 用以鉴别植物抗逆性的强弱。本研究中, 丙二醛含量随着干旱胁迫增强升高, 这与前人的研究结论相一致^[15], 说明干旱对植物具有较强的损伤作用, 使细胞膜破损, 细胞液外渗, 影响紫花苜蓿正常的生长以及组织器官进行正常的生理反应; 接种AMF的处理组产生的MDA含量则显著下降, 这与前人的研究^{[22, 23, 24]}结果一致, 证明接种AMF菌种可以通过提高植株内抗氧化酶活性的方式来共同适应干旱胁迫, 对维持植株正常生长及抗性生长具有重要生态学意义。在水分条件较好的处理组中, 0.25 mmol· L^-1 KH₂PO₄水平下MDA含量高于无磷施入和0.5 mmol· L^-1 KH₂PO₄水平, 而在中度和重度干旱胁迫条件下, 施入磷浓度越高MDA含量则相对越低, 说明在中度至重度干旱时施入磷肥可以降低有害物质的产生。SOD是一种能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质的酶类物质, 当遭遇水分胁迫时, SOD的活性显著降低^{[25, 26]}。在本研究中, 在一定水分条件下(W₂)接种AMF显著提高了紫花苜蓿植株内SOD活性; 且在相同水分条件下, 无论处理组是否接种AMF, 随着施磷量的增加SOD活性呈现下降趋势。这与赵平娟等^[27]的研究结果不尽相同, AMF的接种并未在干旱状态下通过改善SOD酶活性的方式以延缓植株受伤害的速度, 这可能是由于不同品种对于AMF的响应不同, 对不同品种酶活性刺激产生差异。

干旱胁迫随着环境状况的日益恶劣, 已经作为对植物生长状态威胁最大的自然因素被人们广泛关注, 目前已有众多研究人员对提高植株的抗性能力进行了研究。但目前研究较多的是单一改善条件处理对不同种类植株的抗性影响, 对于多种条件联合处理植株的抗性改善作用还不太明了。从理论上讲, 联合施用相对于单一施用具有更好的改善抗性作用, 但也不排除可能存在拮抗作用的情况。

本研究分别以3种条件且分为不同的浓度分别进行处理, 结果表明在特定的干旱胁迫条件下(W₂), 同时施加适量磷并接种AMF联合处理对植株株高的影响相较于相同干旱胁迫条件下的单独处理显著增强; 而在干旱严重的条件下(W₃、W₄), 同时施加适量磷并接种AMF联合处理对植株叶片含水量的影响相较于相同干旱胁迫条件下的单独处理显著增强, 提高了植株的持水能力, 有助于植株抗旱; 而在一定的干旱的条件下(W₃), 同时施加适量磷并接种AMF联合处理相较于单一处理, 减少了植株内的MDA含量, 但在重度干旱条件下(W₄)影响不显著; 而高磷浓度与接种AMF甚至抑制了植株SOD活性, 这可能与磷浓度过高, 使得植株内部抗氧化酶活性受到影响, 导致氧化胁迫的进一步加剧有关^[28]。也可能是由于在菌根共生结构中, 宿主植物紫花苜蓿在为AMF提供碳源的同时, 也从菌根共生体中获得了N、P等营养元素, 因而造成了对试验结果的影响^[29]。而干旱同时也影响了AMF菌丝在根系上的定植, AMF与植株内生真菌和其他微生物之间可能产生的互作效应^[30]以及试验过程不同区域光照强度可能出现的偏差, 均可能使得不同植株之间的生长出现不同程度影响。此外, AMF、适宜磷浓度联合处理在适宜的水分条件下比任一单独处理及两两联合作用产生的效果更优, 虽然联合处理比单独处理植株的抗性更好但其不存在交互作用, 说明在适宜的水分及适宜的磷浓度下这3种条件联合处理仅存在累加作用; 而AMF与较高浓度磷之间存在交互作用且联合作用和单独处理相比没有明显差别甚至有所抑制。说明AMF与高浓度的磷水平间可能存在拮抗作用。

综上所述, 在紫花苜蓿植株中接种AMF及施加磷营养液可以从生长、生理生化指标等多方面显著的改善植株的抗旱能力, 缓解因水分胁迫对植株造成的损伤。其中, 在添加正常磷浓度Hogland(0.25 mmol· L^-1KH₂PO₄)营养液的条件下, 接种AMF对紫花苜蓿干旱胁迫的改善效果最为显著。

(责任编辑 张瑾)