1.1.1 植物材料 黑龙江省农业科学院草业所提供的紫花苜蓿品种“ 农菁1号” 为转基因受体植物。

1.1.2 遗传转化所用的菌株 利用东北林业大学东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室保存的pMD18-T-rgMT质粒, 通过PCR技术在rgMT(带终止子TAA)读码框的前后添加BamH1和SacI酶切位点后连接到pMD18-T载体上, 将添加BamH1和SacI位点的rgMT的T载和以35S为启动子的植物表达载体pBI121分别进行双酶切, 胶回收后利用T4连接酶 (Takara, Japan) 将rgMT基因连接到植物表达载体pBI121上, 再利用电击法将pBI121-rgMT质粒转化到根癌农杆菌菌株EH105中, 用东北林业大学东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室已经建立的苜蓿遗传转化方法^[27], 获得了转rgMT基因苜蓿株系, 以T₀代筛选出的转基因植株分别单株自交产生的T₃代种子作为试验材料。

1.2.1 PCR检测 以质粒DNA为阳性对照, 以野生型植株为阴性对照, 选出9株具有卡那霉素抗性、生长健壮的转基因植株进行检测, 当T₁代植株生长至4~5枚叶片时, 摘取植株上部的幼嫩叶片, 用CTAB法提取植物的DNA, 进行PCR扩增检测。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离, 通过观察特异条带的有无, 判断目的基因是否存在。PCR检测体系为20 μ L, 上游引物序列为:5'-ATGTCTTGCAGCTGTGGATCT-3', 下游引物序列为:5'-TTAGCAGTTGCAAGGGTTGCA-3', 引物由上海生工生物工程公司合成。扩增反应程序为:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 52 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 30个循环; 72 ℃ 10 min。电泳Marker为Takara公司生产的DL2000。

1.2.2 Northern blot检测 为确定rgMT基因在转基因苜蓿中是否稳定表达, 采用Trizol提取法提取野生型和转基因植株的总RNA, 参照Northern blot的方法^[28], 以测序正确的rgMT的T载质粒为模板, 上游引物序列为:5'-ATGTCTTGCAGCTGTGGATCT-3', 下游引物序列为:5'-TTAGCAGTTGCAAGGGTTGCA-3', 以地高辛标记代替dNTP产生的PCR产物为探针, 进一步对这些转基因株系进行了Northern blot检测分析。

1.3.1 子叶期苜蓿耐盐碱性表型分析 选择大小一致、籽粒饱满的野生型和转基因的苜蓿种子(#2), 6%次氯酸钠消毒15 min, 灭菌的蒸馏水冲洗3次, 放置在铺有灭菌滤纸的培养皿中, 在25 ℃培养箱中浸种, 选露白一致的种子, 播种到底部打孔的含有草炭土:蛭石=3:1的塑料营养钵中, 置于温室中, 保持相对湿度70%~80%, 采用自然光照, 昼/夜温度为25 ℃/18 ℃, 每盆定苗4株。在苜蓿生长4周, 只长子叶没有长出真叶时, 选取长势均匀的野生型和转基因苜蓿幼苗, 分别用水(CK)、NaCl(200、300、400 mmol· L^-1)、NaHCO₃(50、100、200 mmol· L^-1)胁迫处理2 d, 每盆50 mL透灌花盆, 每个处理3次重复。

1.3.2 幼苗期苜蓿耐盐碱性表型分析 在花盆中栽培8周的野生型和转基因苜蓿(#2)分别选取长势均匀的幼苗, 分别用水(CK)、NaCl(200、300、400 mmol· L^-1)、NaHCO₃(50、100、200 mmol· L^-1)胁迫处理15 d, 每盆50 mL透灌花盆, 每两天补浇50 mL处理液, 试验设置3次重复。

苗龄8周的野生型和转基因苜蓿经过1.3.2中的NaCl和NaHCO₃处理24 h后, 取相同部位功能叶片, 采用茚三酮法测定脯氨酸含量, 电导仪法测定质膜透性, 氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性^[29], 紫外分光光度法测定过氧化氢(H₂O₂)含量^[30], 取3次重复的平均值进行统计。

将所有试验数据录入Microsoft Excel 2016进行整理、计算并作图。再通过SPSS 17.0统计软件对数据进行单因素方差分析和多重比较。

2.1.1 PCR检测 选出9株具有卡那霉素抗性、生长健壮的转基因植株进行PCR扩增检测, 其中6株转基因苜蓿DNA和质粒DNA扩增出200 bp左右的目的片段条带, 而野生型苜蓿DNA和3株转基因苜蓿DNA则没有扩增出目的条带 (图1 ), 初步表明, 已经获得了rgMT基因整合到农菁1号苜蓿基因组中的转基因苜蓿株系。

图1

Fig. 1

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	图1 转rgMT基因抗性植株的PCR鉴定 M: 2 000 bp marker; CK+: 阳性对照; CK-:阴性对照; #1-#9: 转基因植株。Fig. 1 PCR identification of resistant plants transformed with the rgMT gene M: 2 000 bp marker; CK+: Positive control; CK-: Negative control; #1-#9: Transgenic plants.

2.1.2 Northern blot检测 对PCR阳性植株进行Northern blot分析, 野生型苜蓿为对照, 苜蓿rgMT全长基因标记为探针, 检测rgMT基因在转基因苜蓿中的表达情况(图2), 杂交结果表明, 野生型苜蓿总RNA未与探针杂交出条带, #1和#8杂交出淡淡的条带, #2, #4, #5, #7杂交出的带型比较明显, 尤其是#2转基因苜蓿, 这说明被检测的7个株系中基因均稳定表达, rgMT基因成功遗传转化到紫花苜蓿中, 获得了稳定遗传的转基因株系。

图2

Fig. 2

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	图2 转rgMT抗性植株的Northern blot鉴定 WT: 非转基因植株; #1~#8: 转基因植株; 下同。Fig. 2 Northern blot identification of resistant plants transformed with the rgMT gene WT: wild type plant; #1~#8: transgenic plants; similarly for the following figures.

2.2.1 子叶期苜蓿耐盐碱表型分析 在没有胁迫处理的条件下, 野生型与转基因苜蓿的叶形态都较为正常, 生长未受到抑制, 两者之间没有差异。在200和300 mmol· L^-1 NaCl, 50和100 mmol· L^-1 NaHCO₃胁迫下, 野生型与转基因苜蓿的生长均受到抑制, 野生型苜蓿的子叶生长受抑制比转基因苜蓿更明显, 但叶色均无明显变化。在400 mmol· L^-1 NaCl, 200 mmol· L^-1 NaHCO₃胁迫下, 野生型与转基因的叶色变黄, 生长受到了严重的抑制, 野生型子叶生长更缓慢, 出现干黄甚至死亡, 而转rgMT基因的植株受胁迫比野生型轻(图3)。

图3

Fig. 3

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	图3 逆境胁迫下野生型植株和转基因植株子叶期的生长状况Fig. 3 The performance of wild-type plants and transgenic plants under stress at the cotyledon stage

2.2.2 幼苗期转基因苜蓿耐盐碱性表型分析 对照组野生型与转基因苜蓿的生长都较为正常, 两者之间没有明显差异(图4)。200 mmol· L^-1 NaCl, 50 mmol· L^-1 NaHCO₃胁迫下, 野生型与转基因苜蓿生长受到抑制, 野生型和转基因苜蓿叶片变黄, 野生型受伤害明显, 在300和400 mmol· L^-1 NaCl, 100和200 mmol· L^-1 NaHCO₃胁迫条件下, 野生型与转基因苜蓿生长都受到了严重的抑制, 野生型的叶片变黄、萎蔫甚至死亡, 而转基因株系还带绿色叶片, 有存活的植株。可以看出, 转基因株系的抗逆性高于野生型。

图4

Fig. 4

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	图4 逆境胁迫下野生型植株和转基因植株幼苗期的生长状况 左:野生型植株; 右:转基因植株。Fig. 4 The performance of wild-type plants and transgenic plants under stress at the seedling stage Left:Wild type plant; Right:Transgenic plant.

2.3.1 盐胁迫下苜蓿脯氨酸含量变化 将野生型植株与转基因植株分别用不同浓度的NaCl和NaHCO₃胁迫处理后, 检测其脯氨酸的积累情况(图5)。结果发现, 没有胁迫处理的情况下, 野生型植株与转基因植株的脯氨酸含量无明显差异(P> 0.05)。在盐处理的情况下, 野生型植株与转基因植株的脯氨酸含量均有所提高, 盐胁迫对苜蓿叶片中脯氨酸的影响显著(P< 0.05), 转基因植株比野生型植株的脯氨酸量积累的多, 说明rgMT转化紫花苜蓿在盐胁迫的条件下积累更多的脯氨酸来抵御外界不利的条件。

图5

Fig. 5

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	图5 氯化钠和碳酸氢钠胁迫对苜蓿脯氨酸含量的影响 “ * ” 表示转基因植株与野生型植株之间差异显著(P< 0.05), 下同。Fig. 5 Effects of sodium chloride and sodium bicarbonate stresses on the proline content in Medicago sativa “ * ” indicate significant difference between wild type plant and transgenic plant under stress at the 0.05 level; similarly for the following figuers.

2.3.2 盐胁迫下苜蓿SOD活性检测 在没有逆境胁迫处理的情况下, 野生型植株与转基因植株的SOD活性无明显差异, 在盐胁迫下二者的SOD活性均有提高(图6), 转基因植株比野生型植株的SOD活性高, 说明盐处理条件下苜蓿体内表达的rgMT基因对苜蓿体内抗氧化酶系统的活性有一定的影响。

图6

Fig. 6

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	图6 氯化钠和碳酸氢钠胁迫对苜蓿SOD活性的影响Fig. 6 Effects of sodium chloride and sodium bicarbonate stresses on the SOD activity in Medicago sativa

2.3.3 盐胁迫下苜蓿叶片相对质膜透性分析 在没有逆境胁迫条件下, 野生型植株与转基因植株叶片中的相对电导率基本相同, 即二者的细胞膜透性差异不显著(P> 0.05), 在盐胁迫条件下, 二者的相对电导率均迅速升高(P< 0.05), 说明盐处理对二者的细胞膜均有伤害, 但转基因植株叶片的相对电导率低于野生型植株, 说明在NaCl和NaHCO₃胁迫条件下, 转rgMT基因株系较非转基因株系的细胞膜具有较强的生理活性, 即转基因苜蓿的细胞膜在盐胁迫下受到的伤害比非转基因植株小(图7)。

图7

Fig. 7

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	图7 氯化钠和碳酸氢钠胁迫胁迫对苜蓿叶片细胞膜透性的影响Fig. 7 Effects of sodium chloride and sodium bicarbonate stresses on the relative membrane permeability in Medicago sativa leaves

在胁迫条件下, 植物细胞会产生大量的活性氧, 金属硫蛋白基因具有清除活性氧的功能, 植物中的活性氧含量的多少可以通过测量H₂O₂含量的多少来体现。在没有盐胁迫的条件下, 野生型的苜蓿和转基因苜蓿中的H₂O₂的含量没有明显的差异(P> 0.05), 在盐胁迫条件下, 二者的H₂O₂含量均迅速升高(P< 0.05), 但转基因植株的H₂O₂含量明显低于野生型植株, 说明转基因苜蓿中由于活性氧所带来的对植物伤害要少于野生型苜蓿体内的活性氧伤害(图8)。

图8

Fig. 8

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	图8 氯化钠和碳酸氢钠胁迫对苜蓿H2O2含量的影响Fig. 8 Effects of sodium chloride and sodium bicarbonate stresses on the H2O2 content in Medicago sativa