菌株:放线菌LYZ0255分离自红豆草茎部; 红豆草壳二孢叶斑病致病菌Ascochyta onobrychidis分离于甘肃地区栽培红豆草染病植株。

培养基:放线菌菌株的活化和培养采用高氏一号培养基; 放线菌液体发酵培养基参照范丽霞^[13]筛选的小米培养基1 000 mL:小米1%, 葡萄糖1%, 蛋白胨0.5%, NaCl 0.25%, CaCO₃ 0.1%, (NH₄)₂SO₄ 0.1%, 红豆草壳二孢叶斑病菌的分离和培养采用马铃薯葡萄糖琼脂(potato dexterous agar medium, PDA)培养基。

1.2.1 形态学观察 依照阎逊初^[14]的方法, 将拮抗放线菌划线接种在高氏一号培养基, 采用插片培养法, 在接种点斜45 ℃插入灭菌的盖玻片, 28 ℃培养1周后取出盖玻片在光学显微镜下观察菌丝形态。

用革兰氏染色观察:挑取少许待测菌株置于滴有蒸馏水的载玻片上涂片, 通过火焰3次固定。加结晶紫染色1 min, 水洗; 加碘液染色1 min, 水洗; 加95%的酒精, 脱色30~60 s, 水洗, 吸干水分; 加番红复染1 min, 水洗。吸干或在空气中晾干后, 用油镜镜检, 观察菌株形态特征^[15]。

1.2.2 培养特征和生理生化特性研究 将待鉴定菌株分别接种在高氏一号、克氏一号、察氏琼脂、葡萄糖天门冬素琼脂、葡萄糖酵母膏琼脂、淀粉琼脂等培养基和马铃薯块上^[16], 置于28 ℃恒温培养箱中培养, 分别在7、14和28 d观察并记录气生菌丝、基内菌丝和可溶性色素的颜色变化。取稳定期的颜色特征为期培养特征和定种依据。生理生化特性研究:参照周德庆^[17]和《链霉菌鉴定手册》中所描述的方法, 采用明胶液化、牛奶凝固与胨化、淀粉水解、纤维素水解、硫化氢的产生和碳源利用试验进行待测菌株的生理生化特性测定, 测定结果与文献中所描述标准菌株的生理生化特性进行比对^{[16, 18]}。

1.2.3 16S rDNA序列扩增与分析 待测菌株基因组的提取采用OMEGA Bacterial DNA Kit试剂盒, 按照说明书的步骤进行操作。16S rDNA序列扩增采用细菌通用引物1429R(5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和27F(5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3')由上海生工生物工程技术服务公司合成^[19]。PCR反应条件:95 ℃预变性3 min; 95 ℃变性30 s, 50 ℃退火30 s, 72 ℃延伸60 s, 循环30次; 72 ℃再延伸10 min。PCR扩增采用20 μ L的反应体系, 包括ddH₂O 8.5 μ L, Taq酶 10 μ L, 引物1429R和27F各0.5 μ L, DNA模板0.5 μ L。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后送交上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。将获得序列在EzBioCloud的EzTaxon数据库中进行Blast比对, 下载与待测菌株序列同源性相近的模式菌株序列, 利用MEGA6.0软件采用Neighbor-Joining(N-J)方法构建系统发育树^[20]。

1.3.1 平板对峙试验 用直径5 mm的打孔器将红豆草壳二孢病原菌块接种于PDA培养皿中心, 同时用灭菌的接种针挑取单菌落放线菌接种于距病原菌3 cm处, 每皿点接4个供试菌株, 各点位置成十字形^[21]; 以只接种红豆草壳二孢菌块的处理为对照, 每个处理5个重复, 22 ℃下培养, 待对照长满全皿时, 记录菌落直径, 按照如下公式计算相对抑制率。

相对抑制率=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]× 100% 。

1.3.2 放线菌LYZ0255无菌发酵液的制备 在装有100 mL液体发酵培养基的250 mL的锥形瓶中转接两个放线菌菌饼(直径5 mm, 活化4 d), 在28 ℃、180 r· min^-1条件下培养4 d。将带菌发酵液在无菌环境下取适量装入灭菌的50 mL离心管中, 在4 ℃、8 000 r· min^-1下离心15 min, 去沉淀, 上清液用0.22 μ m细菌过滤器过滤, 即得含放线菌菌株的无菌发酵液(Actinomyces sterile fermentation broth, A-SFB ); 同样条件下未接种放线菌的液体培养基制成不含放线菌的无菌发酵液(sterile fermentation broth, SFB), 得到两种无菌发酵滤液保存于4 ℃冰箱中备用。

1.3.3 LYZ0255无菌发酵液对病菌菌丝生长的抑制作用测定 分别取1 mL备用的A-SFB、SFB和无菌水与9 mL无菌PDA混匀, 制成含有A-SFB、SFB和无菌水的平板培养基(无菌水平板作为对照), 用直径5 mm的打饼器取生长状况一致的红豆草壳二孢菌饼转移至各培养基中央, 在22 ℃恒温培养, 每个处理5个重复, 待对照长满全皿时, 记录菌落直径, 计算菌丝生长抑制率, 方法同1.3.1。

1.3.4 LYZ0255无菌发酵液对病菌孢子萌发抑制作用测定 采用凹片法, 分别吸取100 μ L的A-SFB、SFB和无菌水加入到凹形载玻片中的凹槽中, 再吸取等量的浓度为1× 10⁶个· mL^-1红豆草壳二孢孢子悬浮液加入到上述凹玻片的凹槽中, 将混合的凹载玻片放入到有双层灭菌滤纸的培养皿中, 在恒温培养箱中22 ℃培养, 12 h后检查孢子萌发情况, 每个处理3个重复, 每个重复显微镜下观察5个视野, 统计孢子萌发率, 计算孢子萌发抑制率^[22]。

孢子萌发抑制率=[(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率]× 100% 。

2.1.1 菌落和形态特征 在高氏一号培养基上, 28 ℃恒温条件下该手拮抗菌生长良好, 菌落黄白色(图1A); 基内菌丝无色, 无隔不断裂; 气生菌丝蛛网灰色, 呈树杈状分支(图1B); 孢子丝钩状, 顶端螺旋形(图1C), 孢子圆形或卵圆形。

图1

Fig. 1

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	图1 放线菌LYZ0255菌株的菌落和形态特征Fig. 1 Morphological and cultural characteristics of actinomyces LYZ0255

拮抗菌株在大多数培养基上可产生可溶性色素, 颜色呈黄白色、琥珀色或微黄白色, 仅在察氏琼脂培养基上无可溶性色素产生; 气生菌丝多为灰白色和白色, 在淀粉琼脂培养基上呈黄色; 基内菌丝灰色、褐色、灰褐色或橙黄色, 同时该菌株在不同培养基上生长速度存在差异(表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 拮抗菌株在7种培养基上的培养特征 Table 1 Cultural characteristics of the antagonistic strain on seven different media 培养基 Culture medium 气生菌丝 Aerial hypha 基内菌丝 Substrate hypha 可溶性色素 Soluble pigment 生长状况 Growth state 高氏一号合成培养基 Gause’ s synthetic agar 灰白色 Gray white 灰色 Gray 黄白色 Yellow white 慢 Slowly 克氏一号合成培养基 Krassilnikov’ s synthetic agar 白色 White 褐色 Brown 黄白色 Yellow white 慢 Slowly 察氏琼脂培养基 Czapek’ s agar 灰色 Gray 灰色 Gray - 快 Quickly 葡萄糖天门冬素琼脂培养基 Glucose asparagine agar 白色 White 褐色 Brown 微黄白色 Yellowish white 快 Quickly 葡萄糖酵母膏琼脂 Glucose yeast extract agar 灰色 Gray 灰褐色 Taupe 琥珀色 Amber 快 Quickly 淀粉琼脂培养基 Starch agar 黄色 Yellow 灰色 Gray 琥珀色 Amber 快 Quickly 马铃薯块培养基 Potato dextrose agar 灰色 Gray 橙黄色 Orange yellow 微黄色 Yellowish 快 Quickly

表1 拮抗菌株在7种培养基上的培养特征 Table 1 Cultural characteristics of the antagonistic strain on seven different media

2.1.2 生理生化特征 参照链霉菌鉴定手册中放线菌分类所记载的生理生化试验进行测定, 结果表明, 该菌株明胶液化反应呈阳性, 且明胶液化速度快(图2A); 牛奶凝固与胨化反应呈阳性(图2B); 淀粉水解反应, 菌落周围遇碘不变色形成透明圈, 但透明圈直径小(图2C), 表明该菌株可产生淀粉酶但活性不强; 纤维素水解试验结果为弱阳性, 菌株在纤维素上有一些生长(图2D); 该菌株在柴斯纳(Tresner)琼脂培养基上没有黑色素产生, 不产生H₂S; 该菌株能够利用葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、果糖、蔗糖、木糖和甘露醇作为碳源, 不能利用鼠李糖和肌醇。该结果与《链霉菌鉴定手册》^[15]和《伯杰细菌鉴定手册》(第8版)^[17]中有关微白黄链霉菌Streptomyces albidoflavus所描述的生理生化特征基本相同, 因此, 初步认为菌株LYZ0255为S. albidoflavus。

图2

Fig. 2

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	图2 菌株LYZ0255生理生化特性Fig. 2 Physiological and biochemical characteristics of strain LYZ0255

2.1.3 16S rDNA序列扩增和分析 对拮抗菌株16S rDNA序列进行PCR扩增, 得到约1 400 bp的扩增片段(图3), PCR产物测序结果显示LYZ0255的16S rDNA的全序列由1 388 bp个碱基构成。在EzTaxon数据库中比对结果显示, 与其同源性高的菌株均为链霉菌属(Streptomyces), 相似率在98.34~99.71%, 其中S. albidoflavus(Z76676)与之相似率最高, 为99.71%。基于与其同源性较高的菌株的16S rDNA的全序列构建的系统发育树结果显示, 该菌株与S. albidoflavus(Z76676)聚于同一个进化分支上(图4), 与同源性比对结果一致, 结合形态学特征和生理生化鉴定结果将拮抗菌鉴定为微白黄链霉菌S. albidoflavus。

图3

Fig. 3

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	图3 菌株LYZ0255 PCR扩增结果 M: Marker; L-1/L-2: LYZ0255扩增序列。Fig. 3 Polymerase chain reaction amplification results of the strain LYZ0255 L-1/L-2: The amplification sequence of LYZ0255.

图4

Fig. 4

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	图4 基于16S rDNA序列构建的拮抗菌株系统发育树Fig. 4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of the antagonistic strain

2.2.1 对菌丝生长的的抑制效果 平板对峙试验结果表明, 该链霉菌菌株对红豆草壳二孢表现出很强的拮抗作用, 在对照长满全皿, 对照平板上红豆草壳二孢直径为63.1 mm时, 对峙平板中红豆草壳二孢直径为16.2 mm(图5), 相对抑菌率达74.33%。

图5

Fig. 5

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	图5 拮抗菌对红豆草壳二孢菌丝的平板对峙试验Fig. 5 Dural culture method of the antagonistic strain inhibit Ascochyta onobrychidis

拮抗菌株无菌发酵液对菌丝抑制结果显示, 待对照长满全皿时, A-SFB平板病原菌菌落直径与SFB处理、对照均呈极显著差异(P< 0.01), 其中A-SFB平板对菌丝生长的抑菌率达80.95%(图6), 对红豆草壳二孢病菌菌丝表现出很强的抑制作用; 而SFB平板菌落生长状况与无菌水处理一致, 均对红豆草壳二孢菌丝生长没有抑制作用。

图6

Fig. 6

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	图6 拮抗菌对红豆草壳二孢菌丝的抑菌效果和抑菌率 不同小写字母表示经Duncan新复极差法检验处理间差异显著(P< 0.05), 不同大写字母表示处理间差异极显著(P< 0.01)。Fig. 6 Inhibitory effect of antagonistic strain sterile fermentation broth to mycelium and the inhibitory rates Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments at the 0.05 level by DMRT; different capital letters show significant differences at the 0.01 level by DMRT.

2.2.2 对孢子萌发的抑制作用 用A-SFB处理红豆草壳二孢病原菌孢子, 其抑制病原孢子萌发效果显著, 抑制率达93.87%; 而SFB处理和对照处理一致, 红豆草壳二孢病原孢子多数已经萌发(图7), 说明SFB对红豆草病原菌孢子萌发没有影响。

图7

Fig. 7

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	图7 拮抗菌株无菌发酵液对红豆草壳二孢孢子萌发的影响Fig. 7 Effect of the strain LYZ0255 sterile fermentation broth on spore germination of Ascochyta onobrychis