引用本文
申晓慧. 两种诱变处理对紫花苜蓿种子萌发及植株生理生化特性的影响. 草业科学, 2018,35(6): 1435-1442
Shen Xiao-hui. Effect of two types of mutagens on seed germination and physiological characteristics of alfalfa. Pratacultural Science, 2018,35(6): 1435-1442.  
Doi: 10.11829/j.issn.1001-0629.2017-0404
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《草业科学》编辑部
两种诱变处理对紫花苜蓿种子萌发及植株生理生化特性的影响
申晓慧1,2
1,黑龙江省农业科学院博士后工作站,黑龙江 哈尔滨,150086
2.黑龙江省农业科学院佳木斯分院,黑龙江 佳木斯 154007
通讯作者：申晓慧(1979-),女,助理研究员,博士,主要从事牧草抗性研究。E-mail:[email protected]
收稿日期: 2017-08-09 接受日期: 2017-12-21
资助项目: 黑龙江省博士后特别资助(LBH-TZ06020)
摘要

为了研究诱变处理对紫花苜蓿( Medicago sativa)种子萌发及植株生理特性的影响,以紫花苜蓿Wega7F种子为供试材料,经60Co-γ和甲基磺酸乙酯(EMS)两种诱变处理后,测定种子萌发、幼苗生长及植株生理指标。结果表明,不同剂量60Co-γ射线处理对苜蓿萌发率、发芽指数、幼苗生长的影响不同,低剂量(150 Gy)提高了发芽率、发芽指数及幼苗生长,高剂量(300和450 Gy)抑制萌发率和幼苗生长。EMS处理均抑制苜蓿种子的萌发及幼苗生长。在低剂量条件下,60Co-γ射线处理对株高有促进作用,高剂量会抑制植株生长;EMS处理则抑制苜蓿株高生长。两种诱变处理均促进苜蓿分枝,且低剂量处理下均有利于提高苜蓿单株鲜草产量。在60Co-γ辐射和0.4% EMS处理下,叶绿素含量提高,其他处理叶绿素含量均降低。诱变提高了苜蓿叶片的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性,对3种酶活性的影响程度表现为POD>CAT>SOD。本研究结果表明,150 Gy60Co-γ对苜蓿产量及株高影响显著,为苜蓿生产应用提供了一定利用价值;EMS处理更有利于增强苜蓿分枝能力,有利于苜蓿在观赏方面的提高及改良。

关键词: 60Co-γ辐射;; EMS; 产量性状; 酶活性; 生理特性; 育种改良
中图分类号:S816;S541+.103.52;Q945 文献标志码:A 文章编号:1001-0629(2018)06-1435-08
Effect of two types of mutagens on seed germination and physiological characteristics of alfalfa
Shen Xiao-hui1,2
1.Postdoctoral Workstation of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, Heilongjiang, China
2.Jiamusi Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural science, Jiamusi 154007, Heilongjiang, China
Corresponding author: Shen Xiao-hui E-mail:[email protected]
Abstract

To explore the effects of two types of mutagens on seed germination and physiological characteristics of alfalfa ( Medicago sativa) using Wega7F alfalfa seeds as test materials, this study analyzed seed germination, seedling growth, and physiological characteristics under mutagenic treatments with doses of60Co-γ and ethyl methyl sulfonate (EMS). The results showed that the effects of60Co-γ rays on germination percentage, germination index, and seedling growth varied with dose. A low dose (150 Gy) increased germination percentage, germination index, seedling growth, and plant height, whereas high doses (300 and 450 Gy) reduced germination rate, seedling growth, and plant height. However, treatments with EMS at different doses reduced germination rate, seedling growth, and plant height. The two mutagens increased the branch number of alfalfa. Plant biomass increased with the two mutagen treatments at lower doses. Chlorophyll content increased with60Co-γ irradiation and 0.4% EMS treatment. The activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), and hydrogen peroxidase (CAT) were enhances under the two mutagenic treatments at different doses; the order of activity of the three enzymes was POD>CAT>SOD. The results of this study suggested that60Co-γ at 150 Gy had significant influence on alfalfa yield and plant height; the application of alfalfa has been used to provide certain value. EMS treatments were more effective in increasing the potential for alfalfa branching, which is beneficial for improving the ornamental aspects of alfalfa.

Key words: 60Co-γ radiation;; EMS; yield trait; enzymatic activity; physiological characteristic; breeding improvement

60Co-γ 射线诱变和甲基磺酸乙酯(EMS)诱变是用于改良作物品质性状的常用诱变方式, 通过这些方法, 育种家在改良植物成熟期、产量、株高等方面均取得了显著成效, 培育出了一批优质、高产、高效、多抗的植物新品种, 如水稻(Oryza sativa)、苜蓿(Medicago sativa)等[1, 2]。诱变育种具有比自然突变频率高、变异谱广、诱发创造新的类型、丰富种质资源等特点。但不同植物种子及植株对诱变的敏感性表现不同。已有研究表明, 诱变后种子活力及萌发会发生不同变化[3, 4, 5], 进而影响植物农艺性状及生理特性变化, 如王密等[6]发现诱变能够提高紫花苜蓿的单株株高、分枝数、单株生物量。Maksimoba[7]研究表明, 莴苣(Lactuca sativa)种子经过γ 射线较低剂量辐照后, 其叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素在幼苗中的含量均显著高于对照。王春语等[8]采用EMS处理高粱(Sorghum bicolor)种子, 研究结果表明, 经过0.2%EMS处理20 h为最佳诱变处理时间和浓度, 高粱植株在EMS处理后发生突变的主要特征有叶色、叶形、穗形及生育期等, EMS处理可以对高粱产生丰富的变异类型。前人的研究主要集中在发芽率、株高、过氧化物同工酶、细胞学效应等方面。而在抗氧化酶及相关物质等生理方面的研究报道较少。通过对保护酶活性及丙二醛(MDA)含量的测定, 探讨诱变对其抗氧化酶及相关物质的影响, 对选育新的抗性品种具有重要意义。张忠武等[9]利用EMS处理对豇豆(Vigna unguiculata)种子萌发的生理生化效应及EMS处理半致死剂量的研究结果表明, EMS降低了豇豆种子的发芽势、发芽率, 但提高了幼苗超氧化物歧化酶(SOD)活性。马学敏等[10]研究表明卫星搭载增强了紫花苜蓿叶片的SOD、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性, 减少了MDA的累积, 降低了膜脂的氧化程度, 增强了植株的抗氧化能力。目前对紫花苜蓿诱变研究, 多数仅限于某一性状或生理指标变化的研究, 而对于苜蓿整个生育时期及植株生理变化的系统研究鲜见报道。本研究系统分析了诱变对苜蓿发芽特性、幼苗生长、植株农艺性状及抗氧化酶活性变化的影响, 对苜蓿抗性生理研究具有重要意义。

紫花苜蓿具有高产、稳产、高营养、适口性好等优点[11]。近年来随着国家种植业结构的调整, 黑龙江东北部高寒地区畜牧业不断发展壮大, 但是当地的高寒气候条件, 使得一些紫花苜蓿品种不能完全安全越冬, 降低了苜蓿产草量及品质[12]。因此提高苜蓿生产适应性, 培育优质、高产、抗性强的苜蓿品种已经成为解决高寒地区苜蓿草地成功建植和可持续利用的关键方法之一。本研究拟采用60Co-γ 及EMS两种诱变手段分别对苜蓿种子进行诱变, 研究其对苜蓿种子活力及诱变材料的农艺性状、叶绿素含量、MDA含量及SOD、POD、CAT酶活性变化的影响, 一方面比较探究2种诱变处理对苜蓿生长及生理特性的影响, 另一方面筛选出有利于苜蓿正向变异的诱变处理, 为苜蓿种植生产和诱变育种研究提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料

试验材料为紫花苜蓿, 品种为Wega7F苜蓿, 由黑龙江省农业科学院佳木斯分院提供。种子储存在4 ℃冰箱中, 千粒重为2 295 mg, 发芽率在85%以上。

1.2 试验设计

60Co-γ 射线处理:将Wega7F苜蓿种子在中国农业科学院农产品加工所进行60Co-γ 射线辐照处理, 参照参考文献[13]的研究方法, 分别设为150、300、450 Gy 3种剂量, 以0剂量处理作为对照, 每个处理300粒, 3次重复, 处理时间为7 d。

甲基磺酸乙酯处理:参考文献[14]的研究方法, 将Wega7F种子300粒, 用浓硫酸处理5 min, 之后蒸馏水冲洗5次, 3次重复。在4 ℃磷酸缓冲液(100 mmol· L-l, pH 7.0)中浸泡12 h。然后用磷酸缓冲液配制0.1%、0.2%、0.4%(V/V)的EMS溶液, 室温黑暗条件下处理种子15 h, 期间翻转轻摇, 蒸馏水冲洗, 去除残留的EMS溶液。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 种子发芽特性 使用发芽盒滤纸发芽, 将经过诱变处理的苜蓿种子100粒均匀放入发芽盒内, 移入培养箱, 白天光照8 h, 温度28 ℃, 夜间黑暗16 h, 温度22 ℃。发芽第4天初次计数, 之后每天注意观察种子发芽情况, 10 d后再次计数发芽情况, 共培养至15 d, 3次重复。根据2次计数按以下公式计算种子萌发及活力情况[15]。

发芽势=(前4 d正常种苗数/供试种子数)× 100%;

发芽率=(前10 d正常种苗数/供试种子数)× 100%;

发芽指数GI=∑ (Gt/Dt);

活力指数=G× S。

式中:Gt为t日发芽数; Dt为相应的发芽日数; G为发芽率; S为第10天种苗长。

1.3.2 苗长及根长的测定 在种子发芽第15天时, 根据不同诱变处理, 随机抽取苜蓿幼苗各10株, 用游标卡尺(0.01 mm)测量其幼苗苗长及根长。

1.3.3 苜蓿株高、单株分枝数、单株干草产量及茎叶比的测定 将诱变处理后的种子及对照种子分别浅播于佳木斯分院试验田, 正常肥水管理。于紫花苜蓿盛花期(7月中旬), 每小区随机选取10株, 测定苜蓿株高, 记录各植株的主要分枝数。随机取苜蓿鲜样, 茎叶分离, 60 ℃下烘干至恒重, 测定单株干草产量及茎重和叶重, 计算茎叶比。

1.3.4 叶绿素含量的测定 取紫花苜蓿盛花期(7月中旬)材料相同部位功能叶片, 每处理3个重复。用去离子水洗净其表面杂尘后剪成0.5~1 mm宽碎片, 称量0.3 g于干燥试管中, 加入由分析纯丙酮∶ 无水乙醇=4∶ 1配比的叶绿素浸提液10 mL, 避光浸提24 h[16], 将浸取液稀释适当倍数后, 测定稀释液在波长为663和645 nm下的光密度值, 带入下列计算稀释液中叶绿素a和b的浓度, 并根据稀释倍数和取样量计算叶片的叶绿素a、b含量。用上海奥析UV1901PC紫外可见分光光度计测定。

叶绿素含量用Arnon法的修正公式:

Ca=(12.71A663-2.59A645)× (V/M)× 1 000;

Cb=(22.88A645-4.67A663)× (V/M)× 1 000;

Ct= (8.04 A663+20.29A645)× (V/M)× 1 000。

式中:Ca、Cb、Ct为叶绿素a、b及叶绿素总量, A645、A663表示645、663 nm处吸光度值。V为溶液最终体积(mL), M为叶片鲜重(g)。

1.3.5 酶活性及MDA含量的测定 酶液的提取采用不同处理的紫花苜蓿现蕾期(8月上旬)相同部位新鲜功能叶片, 称取叶片0.5 g, 放入预冷的研钵中, 加入1 mL预冷的酶提取液(50 mmol· L-l的磷酸缓冲液, pH 7.8), 研磨成匀浆, 加缓冲液使终体积为5 mL。在4 ℃条件下以10 000 r· min-1离心20 min。取上清液定容至5 mL。将提好的酶液放入4 ℃冰箱保存, 用于测定抗氧化酶活性测定及MDA含量测定。其中, SOD测定采用氮蓝四唑法; POD测定采用愈创木酚法; CAT测定采用紫外吸收法; MDA测定采用硫代巴比妥酸法测定[17]。

1.4 统计分析

试验数据作图采用Microsoft Excel 2003, 数据分析采用SAS 8.1 (SAS Institute Inc., 2006) 统计软件, 在P< 0.05水平对各试验结果进行方差分析和Duncan多重比较。所有试验设重复3次。

2 结果与分析
2.1 诱变处理对苜蓿发芽特性的影响

诱变处理后的苜蓿种子萌发对不同处理诱变的反应不同(表1)。与对照相比, 60Co-γ 射线处理低剂量下对苜蓿种子发芽势和发芽率均有促进作用, 随着剂量增加由促进萌发转为抑制萌发。EMS对发芽势和发芽率均起到抑制作用。从诱变处理剂量上分析, 60Co-γ 射线在150 Gy处理下, 苜蓿的平均发芽势和发芽率较对照分别提高了10.7%和3.2%; EMS处理后, 苜蓿种子发芽势和发芽率明显低于对照处理, 当处理浓度达到0.4%时, 苜蓿种子发芽势和发芽率分别下降了45.2%和36.0%。这说明高浓度的化学诱变处理会严重的抑制苜蓿种子发芽势和发芽率。

表1 诱变处理对供试苜蓿种子萌发的影响 Table 1 Effect of different mutagenic treatments on germination characteristics of alfalfa

诱变处理后苜蓿种子的发芽指数和活力指数基本上随诱变剂量的增加而下降, 其变化趋势同发芽势和发芽率相一致。在低剂量60Co-γ 射线处理下发芽指数与对照差异不显著; 活力指数与对照差异显著(P< 0.05), 且同一诱变处理下不同剂量之间差异显著。EMS处理下, 除1%处理发芽指数外, 其他处理发芽指数与活力指数均显著低于对照(P< 0.05)。高浓度处理与低浓度处理之间活力指数差异达到显著水平(P< 0.05)。种子的活力指标反映种子的萌发状况, 对于60Co-γ 射线处理, 150和300 Gy处理下活力指数高于对照, 450 Gy处理下活力指数则低于对照, 说明60Co-γ 射线处理苜蓿种子, 150和300 Gy剂量下促进种子萌发, 450 Gy处理抑制种子萌发。EMS处理下苜蓿种子活力指数均显著低于对照(P< 0.05), 说明EMS处理对种子萌发起抑制作用。

2.2 诱变处理对苜蓿幼苗生长的影响

150 Gy 60Co-γ 处理促进Wega7F根长及苗长生长, 但随着处理剂量的增加, 与对照相比, 60Co-γ 处理对根长及苗长生长逐渐由促进生长变为抑制生长(图1)。不同浓度的EMS处理对根长和苗长生长起到明显的抑制作用, 且随着浓度的升高受抑制程度加大, 在各剂量浓度下对根长的影响与对照达到差异显著水平(P< 0.05), 不同浓度EMS处理之间及各浓度与对照之间苗长均达到差异显著水平(P< 0.05)。说明不同诱变处理对种子根长和种苗长的刺激效应不同。两种诱变处理均表现为对根长生长影响强于对苗长生长的影响。

图1 60Co-γ 辐射和EMS诱变对苜蓿根长和苗长的影响Fig. 1 Effect of different mutagenic treatments on root length and shoot length of alfalfa

2.3 诱变处理对苜蓿生长特性的影响

60Co-γ 和EMS处理低剂量下与对照相比促进单株鲜草产量增加, 分别增加了15.8%和0.95%, 但随着处理剂量逐渐增加, 产量逐渐呈下降趋势(表2)。60Co-γ 处理在150 Gy下促进株高增加, 当达到450 Gy时, 株高显著下降, 低剂量与中高剂量之间株高差异显著(P< 0.05)。中高剂量EMS处理抑制株高生长, 且随着浓度增加抑制作用增强, 与对照达到差异显著水平(P< 0.05)。2种诱变处理均促进苜蓿分枝, 60Co-γ 处理的分枝数随剂量降低逐渐增加, 处理与对照间差异不显著, 而EMS处理的分枝数随着处理浓度的增加而增加, EMS在0.4%处理下与对照差异显著(P< 0.05)。除150 Gy 60Co-γ 处理下茎叶比高于对照外, 其他处理下苜蓿茎叶比均低于对照。两种诱变处理下茎叶比均随着处理剂量的增加而下降。

表2 诱变处理对苜蓿农艺性状的影响 Table 2 Effect of different mutagenic treatments on agronimic characteristics of alfalfa
2.4 诱变处理对苜蓿叶绿素含量的影响

由于叶片叶绿素含量及叶绿素a与叶绿素b的比值可以反映出植物品种的适应性, 同时也是对于环境因子利用的一项重要指标, 所以本研究对诱变处理后的叶绿素含量进行了测定。在150和300 Gy 60Co-γ 处理和0.4% EMS处理下苜蓿叶绿素a含量升高, 但与对照差异不显著, 其他处理均低于对照(表3)。不同诱变处理下苜蓿叶绿素b含量与叶绿素a含量变化情况基本一致。60Co-γ 辐射和EMS诱变不同剂量处理下苜蓿叶片的总叶绿素含量与对照相比发生了变化, 但差异不显著。60Co-γ 辐射对苜蓿总叶绿素的影响是随着剂量的增加而下降, EMS处理下总叶绿素则随着浓度的增加而增加。各诱变处理后, 紫花苜蓿叶片叶绿素a与叶绿素b的比值发生了变化, 基本上随处理浓度增加呈下降趋势。

表3 诱变处理对供试苜蓿叶绿素含量的影响 Table 3 Effect of different mutagenic treatment on chlorophyll content of alfalfa
2.5 诱变处理对苜蓿抗氧化物酶活性及MDA含量的影响

60Co-γ 处理促进了苜蓿SOD的积累, 低剂量处理条件下SOD活性显著增加(P< 0.05), 随着剂量增加活性逐渐减弱; EMS处理对苜蓿SOD活性的影响为随着处理浓度的增加SOD活性呈上升趋势, 但各处理浓度下SOD活性均低于对照(表4)。60Co-γ 和EMS处理对苜蓿叶片POD 活性具有明显促进作用, 随着60Co-γ 处理剂量下降, POD活性增强, 低剂量处理下POD活性显著高于对照(P< 0.05); EMS处理则是随着剂量增加, POD活性下降, 但低剂量处理下的POD活性显著高于对照(P< 0.05)。60Co-γ 和EMS处理促进了苜蓿CAT活性, 60Co-γ 对CAT的影响随处理剂量的增加呈下降趋势; EMS处理与对苜蓿CAT活性影响随浓度变化呈“ 高-低-高” 趋势。2种诱变处理对MDA含量的影响与对照相比变化不显著。

表4 诱变处理对苜蓿抗氧化酶活性及MDA含量的影响 Table 4 Effect of different mutagenic treatment on anti-enzyme activity and MDA content of alfalfa

综上所述, 苜蓿经诱变处理后, 酶活性增强。150 Gy 60Co-γ 射线和0.4%浓度EMS处理更有利于提高苜蓿酶活性。

3 讨论与结论

植物种子经过各种诱变以后会发生一系列物理、化学变化, 这些变化在种子萌发及生长过程中会表现出来。本研究中, 60Co-γ 射线处理对种子萌发的变化表现为“ 低促高抑” 。葛维亚等[3]研究认为, 地被菊(Chrysanthemu morifolium)种子在30 Gy以上剂量的60Co-γ 辐射处理下, 其发芽率和幼苗成活率明显下降。李瑜等[18]研究表明, 随着60Co-γ 辐射剂量的增加桂花(Osmanthus fragrans)幼苗出苗率、苗高显著下降。这些与本研究结果相一致。而EMS处理随浓度增加对供试苜蓿种子发芽及幼苗生长均表现明显抑制作用, 这与霍雅馨等[19]利用EMS处理箭筈豌豆(Vicia sativa)种子, 结果表明EMS处理对供试种子有显著抑制作用, 且抑制作用随处理时间的延长而增强的研究结论相符, 说明诱变处理改变了种子细胞呼吸和新陈代谢作用, 在诱变刺激下, 种胚结构和萌发过程的生理代谢活动产生了不同程度的损伤, 促进或抑制了胚中分生组织细胞的分裂和伸长程度, 致使植物种子在发芽及幼苗的生长过程中受到不同程度的影响[20, 21, 22]。

苜蓿营养主要存在于叶片中, 本研究中60Co-γ 射线处理和EMS处理显著降低了苜蓿茎叶比, 说明苜蓿叶片数量或者叶面积在诱变处理后变多或增加, 苜蓿总体叶量提高, 其蛋白含量随之增加, 这就直接提高了苜蓿的品质, 这与杨红善等[23]通过航天诱变对紫花苜蓿田间性状影响的结果研究一致。60Co-γ 射线处理具有促进株高作用, 而EMS处理则抑制苜蓿株高生长, 说明不同诱变处理对苜蓿生长作用效果不同。叶绿素是一类与光合作用有关的最重要的色素。叶绿素含量也是直接反映植物逆境伤害程度的生理指标之一。已有研究表明叶绿素含量越高, 其抗性也越高[24]。本研究中150 Gy 60Co-γ 射线处理和0.4% EMS处理均提高了紫花苜蓿叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量, 这与杨继春等[25]发现番茄(Lycopersicon esculentum)和辣椒(Capsicum annuum)后代经空间处理后, 光合作用增强主要是叶绿体数量增多导致的研究结果相一致。这也充分表明叶绿素含量的高低对光合作用的强弱有直接影响。因此, 诱变处理可以提高苜蓿光合能力, 进而通过提高其光合产物含量来提高苜蓿产量。

植物正常生长条件下, 细胞内自由基的产生与清除处于一种动态平衡状态。当苜蓿受到诱变处理刺激时, 体内的抗氧化酶系统开始启动, 通过增加酶活性来调节细胞代谢平衡[26]。本研究中, 不同诱变处理后, (除EMS处理下SOD活性有所下降外)苜蓿植株SOD、POD和CAT活性均高于对照, 说明诱变后细胞中抗氧化酶活性增加, 有利于清除多余的细胞中活性氧自由基, 抵御诱变伤害; 从MDA含量来看, 诱变导致了MDA含量的升高, 但均与对照无显著差异, 说明抗氧化酶系统对苜蓿起到了保护作用, 使其免受自由基的伤害。

因此, 本研究表明, 60Co-γ 射线处理更有利于提高苜蓿产量及增强生理抗性作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

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